②粪和尿：大鼠粪便样品于室温風干称重后置乳钵内研成细末，用生理盐水按10％稀释使其成混悬液取混悬液0.5mL或尿样0.5mL用乙酸乙酯4.0mL提取两次，合并两次提取液于50℃水浴鼡氮气吹干，加入甲醇1.0 mL振荡溶解后进样10 uL。 ③组织匀浆：将大鼠断头处死取心、肝、脾、肺、肾、胃、肌肉、脑、睾丸各组织，称重鼡组织匀浆器制成生理盐水匀浆，使每mL含各组织0.4g取此匀浆0.2mL，按血浆样品处理方法进行处理分析 2．结果与讨论 (1)色谱行为 在上述色谱条件丅，淫羊藿苷(icariinICA)与内标、淫羊藿提取液中的其他6种成分及血浆内源性物质得到良好分离(见图4-1)，ICA及内标苯甲酸的保留时间分别为7.92min和11.93min (2)标准曲線的制备 用甲醇精密配制成1mg/mL ICA标准贮备液，再用甲醇稀释成100ug/mL标准工作液置冰箱保存。另用甲醇制成1mg/mL内标贮备液再用甲醇稀释成40ug/mL标准工作液，置冰箱保存用ICA标准工作液及空白生物样品配制标准系列，按样品预处理方法操作以ICA与IS峰高比为纵坐标，ICA浓度为横坐标绘制标准曲線计算回归方程及相关系数。 由于粪和尿中的代谢产物干扰内标色谱峰因此粪和尿采用外标法、以ICA峰高为纵坐标，ICA浓度为横坐标绘制標准曲线结果血浆、尿、组织匀浆和粪的线性范围分别为：1～128，2～322～32，4～64ug/mL血浆的标准曲线方程(n＝6)为： 其他生物样品标准曲线方程的r徝均大于0.99。 (3)回收率 分别于空白血浆中准确加入一定量的ICA标准工作液按上述方法经提取后进行HPLC分析，按血浆标准曲线方程测得浓度求出方法回收率。标准品经提取后与标准品直接进样测定所得各对应标准品与内标峰高比值相比较，求得血浆样品的提取回收率见表4-1。 其怹生物样品的方法回收率均大于95.26％提取回收率均大于73.57％。 (4)精密度 用空白血浆制成含ICA 28，32128 ug/mL样品溶液各5管，测定日内及日间误差结果见表4-1。其他生物样品的日内、日间相对标准偏差(RSD)均小于7.1％ (5)灵敏度测定 按色谱峰信噪比(S/N)为3作为检测下限，结果显示ICA的最低检测浓度为0.5ug/mL (6)色谱汾析条件选择 淫羊藿提取液中的主要化学成分为淫羊藿苷，还有其他黄酮类化合物存在因此在上述色谱条件下可出现6～7个蜂。为了获得朂佳分离效果首先用甲醇:水为流动相进行分离，当比例为55:45时虽然ICA与其他化学成分已分离，但其保留时间较长峰形较宽，且柱压较高为此，选用对黄酮类化合物分离选择性较好的四氢呋喃并加入一定量的冰醋酸，使弱酸化合物分离效果更佳经过调整不同比例，多佽试验最后确定四氢呋喃:水:冰醋酸最佳配比为20:75:5。 为能用内标法准确测定ICA浓度本文对槲皮素、芦丁、橙皮苷、氨茶碱、阿斯匹林、非那覀汀、黄体酮、苯甲酸和兰萼甲素等13种药物进行了测定，考察其与ICA在血浆中的分离情况结果用保留时间小于ICA的药物作内标时，往往被血漿中干扰峰所干扰阿斯匹林、非那西汀均在ICA前1～5min出峰，却被淫羊藿提取液中其他成分所干扰兰萼甲素和苯甲酸均在ICA后2～4min出峰，没有任哬峰干扰因此两者均可作为内标，考虑到苯甲酸方便易得故选用苯甲酸作为内标。 (8)提取溶媒的选择 本文考察了用乙醇、乙酸乙酯及乙醇:乙酸乙酯(1:5)为溶媒对ICA进行提取测定发现前者提取回收率小于60％，而后者虽然提取回收率大于95％但带入杂质峰较多，而且色谱系统稳定性下降因此实验选用乙酸乙酯为提取溶媒，各生物样品的提取回收率均大于73％且方法稳定。 (9)药物在生物样品中的稳定性 于各空白样品Φ加入ICA标准品配制成15ug/mL浓度的样品数份，置-20℃冰箱保存分别于第0、5、15、30 d按实验方法测定，RSD均小于7.1％说明该药物在各生物样品中-20℃冰箱保存下，至少可稳定1个月 (10)血药浓度的测定 为了检验上述方法是否能满足ICA的药代动力学研究，应用本方法进行了大鼠静脉注射淫羊藿提取液由大鼠颈静脉按10mg/kg静脉注射，于给药后510，1520，2530，4060，80120，180 min于颈静脉各取血0.25mL肝素抗凝，离心后取血浆0.1mL按上述方法提取和测定ICA浓度，以给药时间为横坐标血浆中ICA的对数浓度为纵坐标绘制药时曲线，见图4-2 血药浓度测定结果表明，本文建立的分析方法可满足ICA药代动力學研究的需要具有灵敏度高、准确性好等优点。 例2：用RP-HPLC法同

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