为什么pcr的pcr标准曲线重复性性会这么不好呢，难道是PC

点击联系发帖人 时间：2017-03-18 03:42

荧光定量pcr是检查什么

在初遇Real time PCR时，就听说这是个实验黑洞，大部分实验菜鸟都会深陷其中，无法自拔。小鱼也曾在Real time PCR这个坑里跌爬滚打了很长时候，同时也积累不少经验。现在就跟大家分享下我做Real time PCR的一些心得吧。

正所谓知彼知己，方能百战百胜。首先我们要先了解下Real time PCR的基础知识。

Real time PCR做为常规PCR的衍生反应，主要是通过荧光信号的变化实时监测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析。

RT-PCR的具体数据就是基线（baseline），荧光阈值（threshold）和Ct值。第 3-15 个循环的荧光值就是基线（baseline），是由于测量的偶然误差引起的。阈值（threshold）是指在扩增曲线的指数增长区域内的适当位置上设定的荧光检出界限，一般是基线的标准偏差的 10 倍。Ct 值就是每个反应管里的荧光值达到阈值时的 PCR 循环次数。Ct 值跟初始模板的量成反比。

Real time PCR 的标记方法一般包括以下几类：荧光染料嵌合法（SYBR Green I）和荧光探针法(Taqman探针）和分子信标法。

三种荧光定量PCR方法的应用比较

荧光定量PCR的主要应用

原理清楚了，接下来就是实验操作及数据分析了。就在这一步，RT-PCR准备了很多大坑静待我们跳进去。难怪之前的学长要告诉小鱼，这个实验做多了，很有可能会成为思想家。果不其然，小鱼在这个实验上失败了N多次且寻觅原因无果后，便开启了哲学模式，一开口就是些人生感悟，满满的沧桑感。

那么RT-PCR究竟难在哪里呢？又该怎么处理呢？

TaqMan探针的设计和荧光标记物选择

一般，DNA样品的定量标准品为基因组DNA&质粒，RNA样品的定量标准品为Total RNA&cDNA&体外转录RNA。绘制标准曲线的标准品梯度的选择一般为5~6个梯度，标准品的稀释倍数通常为10。

SYBR Green I 法进行检测时，可根据熔解曲线确认PCR产物的特异性。曲线横坐标是温度，纵坐标是荧光强度的变化值（不是强度本身）。其原理是依据温度从60度升至90度时，荧光强度的变化值。当温度达到PCR产物的Tm（双链DNA分子解链一半时的温度）时，荧光强度变化最大（峰值）。

绝对定量中，LOG（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可制作出标准曲线，即得到该扩增反应存在的线性关系。然后根据样品的Ct值，来确定未知样品的初始模板拷贝数或浓度。通常用于病毒、细菌、衣原体、支原体的定量检测及转基因食品的检测。

相对定量用于测定单个样品基因的差异表达分析或者比较两个或两个以上样品中某个基因表达量的变化，则其结果必须用内对照基因（管家基因）校正。管家基因通常指维持细胞基本代谢活动所必须的基因，如GAPDH/Actin/18s rRNA等，实际操作中可依据文献或具体实验进行筛选。相对定量的分析方法主要有两种：双标准曲线法和2^-△△Ct法。

每次实验都要分别用标准品做内参基因和目的基因的标准曲线，并同时扩增各待测样本中的目的基因和内参基因。然后使用标准曲线来计算待测样本中的目的基因和内参基因的表达量。最后通过公式就可以计算出目的基因的表达差异了。

这是最常用的进行相对基因表达分析的方法，得到的结果是实验组中目的基因相对于对照组中目的基因表达的差异倍数。要求目的基因和内参基因的扩增效率相同，且相对偏差不超过 5%。

若是目的基因和内参基因的扩增效率不一样时，可以套用以下公式来计算基因表达的差异。

其中，E1：目的基因引物扩增效率；E2：内参基因引物扩增效率；△Ct1：实验组目的基因Ct值差；△Ct2：对照组目的基因Ct值差。（E1=E2=1时，该公式=2^-△△Ct）。

如此下来，小伙伴是否觉得Real-time PCR并没有想象中那么难呢？那就快快行动起来，一举把该实验拿下吧！

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相对定量的时候并不需要标准曲线

只有绝对定量需要标准曲线

标准曲线目的基因和内参需要一起跑，否则没有意义~

从图上看你的稀释范围不太够，我们一般从10的-2 一直做到10的-9

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荧光pcr扩增效率过高:荧光定量pcr标准曲线中的扩增效率太高怎么

摘要： 荧光定量pcr标准曲线中的扩增效率太高怎么办做荧光定量标准曲线，同时做β-actin和自己的基因SA，结果相数为.... 、调整系，不要自己配置反应液，最好用商...

问：荧光定量PCR扩增曲线基线过高什么原因
答：荧光定量PCR扩增曲线基线过高什么原因ROX加多了，终浓度太高？或者模板量，PCR扩增效率低下？

问：荧光定量pcr标准曲线中的扩增效率太高怎么办做荧光定量标准曲线，同时做β-actin和自己的基因SA，结果相数为....
答：、调整系，不要自己配置反应液，最好用商品的MIX，这样各个组分都是最佳的配比。、三步法改为两步法，退火延伸设置为步，大部分的度为度，这个只是...

问：荧光定量PCR技术中的扩增效率什么意思
答：PCR原理中，反应个循环，PCR产物扩增倍，即为之前的倍。反应N个循环，理论上应为原来的的N次方。此时，理论的扩增效率是%，即。但实际上，由于酶，...

问：我做荧光定量PCR标准曲线时，斜率只有-.，扩增效率E很高。...
答：扩增效率理论上不可能超过。计算值超过，可能是因为PCR效率不高或者不稳定，结果线度差，导致某个间的数据点计算出来的扩增效率反而大于.这样的标准曲线...

问：如何判断PCR扩增效率的致
答：涉及到效率问题，如果要做的精细，需要通过realtime才能知道。但是如果做的粗略，通过半定量可能也大概可以知道。

问：PCR扩增仪与实时荧光PCR仪有何别？PCR扩增仪和实时荧光PCR仪有何别啊？检测食品中转基因成分，是不是两个设备都...
答：用我自己的话说，就是PCR扩增仪是普通的PCR反应，反应后产物般通过电泳查看结果。实时荧光PCR即real-time PCR，是在反应体系中加入目的基因的探针，PCR过程中...

问：实时荧光定量PCR扩增仪可分为什么？
答：实时荧光定量PCR扩增仪可分为什么？没有按照仪器的分类。但ABI的机器要加入rox dye对各个样本做均处理，

问：谁知道PCR？生物、基因类的啦谁知道PCR？生物、基因类的啦
答：免疫PCR免疫PCR(Immuno PCR,Im-PCR)、定义；免疫PCR是利用抗原抗体反应的特异和PCR扩增反应的极高灵敏而建立的种微量抗原检测技术。用抗体检测抗原是...

问：荧光定量PCR的主要原理以及与传统PCR比较的优点
答：实时荧光定量PCR—种科学准确的定量方法实时荧光定量PCR技术于年由美国Applied Biosystems推出,由于该技术不仅实现了PCR从定到定量的飞跃,而且与...

问：绝对荧光定量PCR的数据分析般做实时荧光定量PCR的数据分析都采用相对定量方法，我想做绝对定量PCR，请问...
答：现在最常用的两种分析实时定量PCR实验数据的方法是绝对定量和相对定量。绝对定量通过标准曲线计算起始模板的拷贝数；相对定量方法则是比较经过处理的样品和未经...

问：荧光球发光,绿、红交替闪烁，是何原理？
答：这个问题应该放在别的页面上吧?这里是育婴的．荧光染料荧光基团通常各自拥有单的光吸收峰。在光的刺激下，荧光基团吸收光的能量后通常以三种方式释放出能量...

问：病有谁去验过病吗，是当天得结果吗，申请验这个是不是很遭歧视啊
答：病主要的检测方法有以下几种：（）抗体检测主要有酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫荧光试验（IFA）。ELISA用去污剂裂解HIV或感染细胞液提取物作抗原，IFA...

问：关于乙型肝炎病dna荧光定量 fq-pcr法上个星期去抽血验了肝功和dna，肝功非常正常，草酶/丙酶比值 AST/ALT....
答：般来讲，乙肝主要是通过血液、母婴和三个途径传播，日常生活接触是不会传染的。多人都认为乙肝病不经肠道传播，也就是说，与乙肝病人或病携带者共餐是...

问：白炽灯、荧光灯、LED灯的发光效率如何？白炽灯、荧光灯、LED灯的发光效率如何？
答：白炽灯和卤钨灯，其光效为～流明／瓦；荧光灯和HID灯的光效为～流明／瓦，而LED灯预计可达到流明/瓦，目前可以流明/瓦，并成功应用与实践中。

答：airrong我对乙肝的了解也只是最近，因为最近朋友得了大三阳，所以也借此机会补了于乙肝的课程，买了几本书，看了看，谈下我的看法：对你不尊重别人...

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