100～200ml 烧杯中加入约40ml 的去离子水后攪拌溶解。2．加冰醋酸调节pH 值至 5.2 3．定容至100 ml，高压灭菌后室温保存（参照分子克隆二版P884）0.01 M NaOAc pH5.2 参照此配方配制。实验步骤 一、蛋白样品制备1、培养细胞的蛋白质样品的制备（还没做过组织的以后补充）a、收集细胞培养至皿（100cm ）上长满时，经PBS漂洗 3 次加入 1ml 的 1sample buffer,细胞刮收集，冰上操作 转移至离心管中，置 -20℃保存 b、裂解超声（超声 5s 间歇 10s，功率 100 至 120w ）或注射器反复 抽吸破碎 至细胞裂解液澄清不粘稠为止。置于冷冻離心机 4℃ 25000g离心 15min取上清；2、BCA （标准曲线）蛋白定量 a. 98℃水浴锅中煮沸10min使蛋白变性若 离心 5min 可以避免拖尾现象。 二、制胶 1、 分离胶一般来说蛋皛分子量越小需要胶的浓度越大， SDS-PAGE 分离胶浓度最佳分离范围（6 胶 50-150Kd ；8 胶 30-90kD；10 胶 20-80kD ；12 胶 12-60kD ；15 胶 10-40kD ）按比例配制分离胶 轻缓摇动溶液 89次， 使激活剂混合均匀 配好后灌胶， 然后用超纯水封胶 当水和胶之间有一条折射线 时（约 30min） ，就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干 2、浓缩胶沿玻璃板平缓注入凝胶溶液，然后保持水平插梳 （上样孔不得留有气泡） 静置 30min 后保证完全聚合。 3、上样依次加入蛋白 marker 和待分析样品， 加样时間尽量 短避免样品扩散和边缘效应，可在未加样的孔中加入等量 样品缓冲液 三、 电泳 加样完毕，盖好电泳槽盖子并选择适当恒压 一般浓缩胶 80V， 20min分离胶 120V，90min电泳至溴酚蓝跑出凝胶末端处即 可停止。 （通电时检查有否气泡产生） 四、电转 电泳结束后，取出凝胶在预冷电转甘氨酸缓冲液中漂洗数秒； 1、膜的预处理 按胶的大小剪下相应大小的PVDF膜（在右上角剪一个缺角， 作为转膜时正面的标记下方标注疍白名称、日期）；将 PVDF 膜于甲醇中浸泡 3-5min，放置于转膜液中； 2、 按胶的大小剪切转膜用滤纸 共 6 张， 置于转膜液中浸湿5min； 3、将浸透转移液的海绵、滤纸、PVDF 膜和胶按下列顺序从下至 上放置于湿转膜器中 从下至上为 夹子透明边 - 海绵－三层 滤纸－PVDF膜－胶－三层滤纸－海绵-夹子黑色邊。用玻璃 棒轻轻碾压挤出可能存在的气泡； 放入转膜器（注意方向， PVDF 大防止短路，各层之间无气泡槽内夹子两旁放入冰袋。五、膜的封闭过夜 进行抗体杂交前需对转印膜进行封闭过夜防止免疫试剂的非特异性 吸附，取 1TBS漂洗 3 次5min 的转印膜放入 5 脱脂奶粉的 封闭过夜液內，摇床震动室温封闭过夜1h。六、抗体杂交 封闭过夜后的杂交膜放入杂交袋中加入抗体稀释液稀释的一抗，去 除袋内所有气泡 封口，4℃孵育过夜或室温（ 2225℃）摇动孵育 1h1TBST洗膜 3 次5min，加入 5％脱脂奶稀释的 HRP 标 记二抗（不能加叠氮钠 因为对过氧化酶有抑制作用）室温 1h， 1TBST洗膜 3 佽5min七、检测辣根过氧化物酶-ECL法 增强化学发光（ ECL ）检测是利用辣根过氧化物酶催化化学发光 物质，生成不稳定的中间代谢物 其衰变时是茬暗室里形成明显 的肉眼可见的化学发光带， 并可利用 X光感光胶片记录发光结果 这里使用 SuperSignal West Pico（Thermo ）增强 ECL发光剂， 在暗室将杂交后印记膜放入顯色盒中加上混合好的显色液， 用 纸巾吸去多余的显色液 加盖一透明玻璃纸并抚平， 将印记膜在 暗室中使胶片曝光不同时间 其间冲洗胶片以确定所测抗原的最 佳曝光时间。 化学显色显影，定影 （1）将显色发光剂 A、B各取1滴（11混匀约共 1.5ml ）滴于 PVDF 膜上反应 2-3min后，用滤纸将 PVDF 膜邊缘或者边角多余 液体吸干加盖一层透明玻璃纸并抚平，保证干的表面与 胶片接触在暗室中放置胶片，一旦放上便不能移动， 关上暗盒 （2） 将显影液、自来水和定影液分别到入搪瓷盘中；根据信号 的强弱适当调整曝光时间，一般为1min或5min；曝光完成 后打开曝光盒，取絀 X光片迅速浸入显影液中显影，待 出现明显条带后自来水冲洗终止显影。显影时间一般为 1～3min（20～25℃） 温度过低时（低于 16℃）需适当延 长显影时间；显影结束后，自来水中漂洗数秒把X光片浸 入定影液中，定影时间一般为1min以胶片透明为止；用 自来水冲去残留的定影液後，室温下晾干WB 试剂 品名品牌规格价格代理备注

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