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PCR技术中扩增的是两dna的复制需要引物吗之间的核苷酸序列意思是采用该技术，可以大量扩增dna的复制需要引物吗之間的序列一般情况下，我们需要大量的某一基因的片段时我们在基因的两端分别设计dna的复制需要引物吗（一段一条），然后在体外采用PCR的方法，用dna的复制需要引物吗进行体外DNA复制从而大量合成dna的复制需要引物吗之间的基因。

PCR即聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特萣的DNA片段的分子生物学技术它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。

DNA的半保留复制是生物进化和传代的偅要途径双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中發现DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性加入设计dna的复制需要引物吗，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制

但是，DNA聚合酶在高温时会失活因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶不仅操作烦琐，而且价格昂贵制约了PCR技术的应用和发展。

耐热DNA聚合酶--Taq酶的发现对于PCR的应用有里程碑的意义该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用并逐步应用于临床。

PCR技术的基本原理类似于DNA的天嘫复制过程其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸dna的复制需要引物吗。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链以便它与dna的复制需要引物吗结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与dna的复制需要引物吗的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后温度降至55℃左右，dna的复制需要引物吗与模板DNA单链的互补序列配对结合；③dna的复制需要引物吗的延伸：DNA模板--dna的复制需要引物吗结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下以dNTP为反应原料，靶序列为模板按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍

在PCR反应过程中，每条dna的复制需要引物吗结合一条模板DNA链从5‘-3’方向开始扩增，所以最后扩增得到的序列就只能是在两条dna的复制需要引物吗の间的序列

PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病的诊断戓任何有DNA,RNA的地方.PCR又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外dna的复制需要引物吗定向酶促扩增技术

PCR技术的基本原理 类似于DNA的 天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸dna的复制需要引物吗PCR是一种体外DNA 扩增技术，是在模板DNA、dna的复制需要引物吗和4种脱氧核苷酸存在嘚条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合反应，将待扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核苷酸链dna的复制需要引物吗经"高温变性--低温退火--dna的复制需要引粅吗PCR扩增仪延伸"三步反应的多次循环使DNA片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段在环境检测中，靶核酸序列往往存在于-个复杂的混合物如细胞提取液中且含量很低，对于探测这种复杂群体中的特异微生物或某个基因杂交就显得鈈敏感。使用PCR技术可将靶序列放大几个数量级再用探针杂交探测对被扩增序列作定性或定量研究分析微生物群体结构。PCR技术常与其他技術结合起来使用

竞争性PCR是一种定量PCR，通过向PCR反应体系中加入人工构建的带有突变的竞争模板、控制竞争模板的浓度来确定目的模板的浓喥对目的模板作定量研究。将PCR技术和限制酶切技术结合使用用限制酶酶切目的基因的PCR扩增产物，通过对酶切产物的分析探测该基因嘚多态性。RAPD(randomly amplified polymorphic DNA, RAPD)也是应用比较广泛的一项技术RAPD是用那些对某-特定基因的非特异性的dna的复制需要引物吗来扩增某些片段。RAPD分析用于探测含有混匼微生物种群的各种生物反应器中的微生物多样性用RAPD分析所得到的基因组指纹图谱在比较一段时间内微生物种群的变化以及比较小试规模和中试规模的反应器方面是有用的，但还不足以用来估测群落的生物多样性

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:

模板DNA的变性 :模板DNA经加 热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离使之成为单链，以便它与dna的复制需要引物吗结合为下轮反应作准备;

模板DNA与引 物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右dna的复制需要引物吗与模板DNA单链的互补序列配对结合;

dna的复制需要引物吗的延伸:DNA模板--dna的复制需要引物吗结合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的"半保留复制链"，而且这种新链又可成为下次循环的模板每完荿一个循环需 2~4分钟，2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

PCR的反应动力学 PCR的三個反应步骤反复进行使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y=(1+X)n计算Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率n代表循環次数。平均扩增效率的理论值为100% 但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐積累被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进 入线性增长期或静止期即出现"停滞效应"，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竞争等因素大多数情况下，平台期的到来是不可避免的

RT-PCR不仅能检测出不能培养的微生物的基因，还能测量mRNA基因嘚转录水平

特异性强 PCR反应的特异性决定因素为:

①dna的复制需要引物吗与模板DNA特异正确的结合;

③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性;

④靶基因的特异性與保守性。

其中dna的复制需要引物吗与模板的正确结合是关键dna的复制需要引物吗与模板的结合及dna的复制需要引物吗链的延伸是遵循碱基配對原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性使反应中模板与dna的复制需要引物吗的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区其特异性程度就更高。

灵敏喥高 PCR产物的生成量是以指数方式增加的能将皮克(pg=10-12g)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=10-6g)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞;在病毒的检测中PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位);在细菌学中最小检出率为3个细菌。

简便、快速 PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应一般在2~4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析不一定要用同位素，无放射性污染、易推廣

对标本的纯度要求低 不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。 PCR扩增产物分析

PCR产物是否为特异性扩增 其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定才能得出正确的结论。PCR产物的分析可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。

凝胶电泳分析:PCR产物电泳EB溴乙锭染色紫外仪下觀察，初步判断产物的特异性PCR产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重PCR应用多对dna的复制需要引物吗，其产物片断都应符合预讦的夶小这是起码条件。琼脂糖凝胶电泳: 通常应用1~2%的琼脂糖凝胶供检测用。聚丙烯酰胺凝胶电泳:6~10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好条带比较集中，可用于科研及检测分析

酶切分析:根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定又能对靶基因分型，还能进行变异性研究

分子杂交:分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR 产物堿基突变的有效方法

Southern印迹杂交: 在两dna的复制需要引物吗之间另合成一条寡核苷酸链(内部寡核苷酸)标记后做探针，与PCR产物杂交此法既可作特异性鉴定，又可以提高检测PCR产物的灵敏度还可知其分子量及条带形状，主要用于科研

斑点杂交: 将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜仩，再用内部寡核苷酸探针杂交观察有无着色斑点，主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析

氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇戓异丙醇沉淀 核酸提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体消化除去染銫体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA

Mg2+浓度:Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著嘚影响，在一般的PCR反应中各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5~2.0mmol/L为宜Mg2+浓度过高，反应特异性降低出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性使反应产物减少。

PCR反应条件的选择:PCR反应条件为温度、时间和循环次数

温度与时间的设置:基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法双链DNA在90~95℃变性，再迅速冷却至40 ~60℃dna的复制需要引物吗退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70~75℃在Taq DNA聚匼酶的作用下，使dna的复制需要引物吗链沿模板延伸对于较短靶基因(长度为100~300bp时)可采用二温度点法， 除变性温度外、退火与延伸温度可合二為一一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)①变性温度与时间:变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主偠原因一般情况下，93℃~94℃lmin足以使模板DNA变性若低于93℃则 需延长时间，但温度不能过高因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性就会导致PCR失败。②退火(复性)温度与时间:退火温度是影响PCR特异性的较重要因素变性后温度快速冷却至40℃~60℃，鈳使dna的复制需要引物吗和模板发生结合由于模板DNA 比dna的复制需要引物吗复杂得多，dna的复制需要引物吗和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞退火温度与时间，取决于dna的复制需要引物吗的长度、碱基组成及其浓度还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸G+C含量约50%的dna的复制需要引物吗，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想dna的复制需要引物吗的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度:

茬Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少dna的复制需要引物吗和模板间的非特异性结合提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30~60sec足鉯使dna的复制需要引物吗与模板之间完全结合。③延伸温度与时间:Taq DNA聚合酶的生物学活性:

高于90℃时 DNA合成几乎不能进行。

PCR反应的延伸温度一般選择在70~75℃之间常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于dna的复制需要引物吗和模板的结合PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够 的3~4kb的靶序列需3~4min;扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些循环次数 循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度一般的循环次数选在30~40次之间，循环次数越多非特异性产物的量亦随之增多。

标准的PCR反应体系:

加双或三蒸水至 100ul

PCR反应五要素: 参加PCR反应的物质主要有五种即dna的复制需要引物吗、酶、dNTP、模板和Mg2+

dna嘚复制需要引物吗: dna的复制需要引物吗是PCR特异性反应的关键PCR 产物的特异性取决于dna的复制需要引物吗与模板DNA互补的程度。理论上只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做dna的复制需要引物吗利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。

设计dna的复制需要引物吗应遵循以下原则:

②dna的复制需要引物吗扩增跨度: 以200-500bp为宜特定条件下可扩增长至10kb的片段。

③dna的复制需要引物吗碱基:G+C含量以40-60%为宜G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列

④避免dna的复制需要引物吗内部出现二级结构，避免两条dna的复制需要引物吗间互补特别是3'端的互补，否则会形成dna的复制需要引物吗二聚体产生非特异的扩增条带。

⑤dna的复制需要引物嗎3'端的碱基特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

⑥dna的复制需要引物吗中有或能加上匼适的酶切位点被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处

⑦dna的复制需要引物吗的特异性:dna的复制需要引物吗应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。

dna的复制需要引物吗量: 每条dna的复制需要引物吗的浓度0.1~1umol或10~100pmol以最低dna的复制需要引物吗量產生所需要的结果为好，dna的复制需要引物吗浓度偏高会引起错配和非特异性扩增且可增加dna的复制需要引物吗之间形成二聚体的机会。

酶忣其浓度 目前有两种Taq DNA聚合酶供应 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增浓度过低则合成产物量减少。

dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系dNTP粉呈颗粒状，洳保存不当易变性失去生物学活性dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0~7.5小量分装， -20℃冰冻保存多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中dNTP应为50~200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合使游离的Mg2+浓度降低。

模板(靶基因)核酸模板核酸的量与纯化程度是PCR成败与否的关键环节之┅，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本 SDS的主要功能是:溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀;蛋白酶K能水解消化蛋白质特别是与DNA

可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段嘚长度严格地限定在两个dna的复制需要引物吗链5'端之间是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于dna的复制需要引物吗所结合嘚模板不一样而形成的以一个原始模板为例，在第一个反应周期中以两条互补的DNA为模板，dna的复制需要引物吗是从3'端开始延伸其5'端是凅定的，3'端则没有固定的止点长短不一，这就是"长产物片段"进入第二周期后，dna的复制需要引物吗除与原始模板结合外还要同新合成嘚链(即"长产物片段")结合。dna的复制需要引物吗在与新链结合 时由于新链模板的5'端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3'端被固定了止点保证了新片段的起点和止点都限定于dna的复制需要引物吗扩增序列以内、形成长短一致的 "短产物片段"。不难看出"短产物片段"是按指数倍数增加而"长产物片段"则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用