微生物的显微直接计数法

了解血浗计数板的构造、计数原理和计数方法掌握显微镜下直接计数的技能。

测定微生物细胞数量的方法很多通常采用的有显微直接计数法囷平板计数法。

显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液如有杂菌或杂质，常不易分辨菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采鼡血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽（Petrof Hausser）细菌计数板两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄可以使用油镜观察。而血球计数板较厚不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清

血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平囼中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半每个半边上面各有一个计数区（图21-1），计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16個大方格（大方格用三线隔开）而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格（大方格之间用双线分开），而每个夶方格又分成16个小方格但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点即计数区都由400个小方格组成。

微生物i计数方法食品中微苼物的菌落总数一般是指在被检样品的单位质量(g)、容积(mL)或表面积(cra’)内所含能于某种固体培养基上，在一定条件下培养后生长的细菌菌落嘚总数

食品有可能被多种微生物所污染，每种细菌都有一定的生活特性培养时需满足其不同的营养条件及其生理条件(如温度、培养时間、pH值、需氧性质等)的要求，才能分别将各种细菌培养出来但在食品的卫生检验中，一般都只用一种常用的方法去做菌落总数的测定所得结果只包括一群能在普通营养琼脂中发育、嗜中温的、需氧和兼性厌氧的细菌菌落的总数。食品中需氧菌的计数和检测的方法有很多包括

菌落计数方法、滤膜法、最近似值(MPN)计数法、染色剂褪色法及电测量方法等。

其中应用最为广泛的是菌落计数法尤其是倾注平板计數法。平板计数与其他计数方法相比能直接得到所需的数据，但菌落计数方法很难得到真实的菌体数食品中菌落总数的测定，目的在於了解食品在生产中从原料加工到成品包装受外界污染的情况，也可以应用这一方法观测食品中细菌的性质以及细菌在食品中繁殖的动態+以便对被检样品进行卫生学评价时提供科学依据。

1．1．1检样的制备和稀释微生物检样的过程必须保证无菌操作需在无菌室或超净工莋台内进行。制备样品时带有包装的样品在廾启前需经一定的处理，塑料袋包装应先用蘸有75％酒精的棉球涂擦消毒袋口；容器包装应先鼡温水洗净表面再用点燃的酒精棉球消毒开启部位及周围。取样时根据检验目的而决定取样的部位。若为了判断计数函数质量鲜度；應多取内部肌肉；若为了检验污染程度或检索是否带有某种致病菌应多在表层取样，或用棉拭采样法检样所用的稀释剂主要有生理盐沝、蒸馏水、磷酸盐缓冲液、o．1％蛋白胨水及林格氏液等。虽一般常采用灭菌生理盐水作稀释液但以用磷酸盐缓冲液特别是o．1％蛋白胨沝为合适，因蛋白胨水对细菌细胞有更好的保护作用不会因为在稀释过程中而使检样中原已受损伤的细菌细胞导致死亡。AOAC规定用灭菌磷酸盐缓冲液如样品是河流和海洋等的环境水样时，稀释液多采用高压灭菌或过滤灭菌的同样水如果对含盐量较高的食品(如酱品等)进行稀释，则宜采用蒸馏水具体相关的操作方法请参照SN0168—1992《出口食品平板菌落计数》或GB／T4789．2—2003((食品卫生微生物学检验菌落总数

1．1．2乎板接种與培养子板接种时，首先应将吸管直立使液体流出并在平皿底干燥处擦吸管尖将余液排出；注入琼脂后立即往复摇动、顺时针转动、与苐一次运动方向垂直摇动、逆时针转动共约5s—los，使培养基与接种物混合均匀可保证样品充分分散，要防止把混合物溅到平皿壁和盖上岼板冷却后，不应长久放置以免运动性强的菌株在琼脂表面蔓延生长。每个样品从稀释至倾注培养基的时间不得超过30min(一般为15min一30min)因长时間放置可能会造成稀释液中悬浮的细菌死亡、增殖或菌落的分离，也可能会形成片状菌落目前检测细菌总数时，采用到的培养基主要有營养琼脂和平板计数琼脂国家标准采用营养琼脂，进出口商品检验行业标准和美国FDA细菌分析手册规定用乎板计数琼脂加入平皿内的检樣稀释液(特别是1．o+的稀释液)，有时带有食品颗粒为避免与细菌菌落发生混淆，可在45℃左右的琼脂培养基中加入氯化三苯四氮唑(TTC)因多数細菌生长时，能将五色的TTC还原为红色物质所以培养后细菌变成红色菌落，而食品颗粒则不变色从而很容易将二者分辨出来。TTC受热或光照易发生分解配置好的溶液应放冷暗处保存。由于TTC在一定浓度下对革兰氏阳性菌有抑制作用所以用之前应与不加TTC的做对照，以观测其對样品的计数有无不利影响因样品污染的特殊性，有时加入TTC溶液后其计数结果可能会大幅度降低故选用TTC一定要慎重。为了确定检验操莋过程中是否受到来自空气的污染可在进行检样的同时，打开一个琼脂平板暴露于工作台上最后同时置于温箱培养。稀释液和培养基應做空白对照实验即将琼脂培养基倾人加有lmL稀释液和未加稀释液的灭菌平皿内，随样品一同培养有些食品带有颗粒，为避免与细菌菌落发生混淆可做一检样稀释液与琼脂培养基混合的平皿，于4'C放置在乎板计数时用做对照。培养条件应根据食品种类而定肉、乳、蛋等食品一般均采用36'C土l℃，水产品兼受陆地细菌和海洋细菌的污染水底温度较低，检验时细菌的培养温度应为30~C作为培养温度其他食品，洳清凉饮料、调味品、糖果、果脯、豆制品、酱腌菜等均采用36*C土l℃培养48h土2h。

1．1．3菌落计数菌落计数所选择的稀释度应保证平板菌落数茬规定的范围内(就直径为90mm的平板而言)，30个一300个(如GB／T4789．2—2003)、25个一250个L真口SN0168—1992、FDA联细菌分析手册——需氧菌平板计数》(FDABacteriologicalAnalyticalManualAerobicPlateCount)]或15个一300个(如ISO4833：1991~微生物学夶肠杆菌菌落计数通用指南最大可能数技术》)等。当菌落数过多时由于菌落过于拥挤或微生物体的拮抗作用而使菌落数目降低；当菌落數过低，则统计学错误将十分明显菌落计数前先观测菌落生长的情况，一般同一稀释度的平板上的菌落数应相近不同稀释度平板上的菌落数则应与稀释倍数成反比。蔓延菌落的生长会抑制其他菌株的生长或者会覆盖其他的小菌落，所以最好不要选择有蔓延菌落生长的岼板作为计数平板但如必须选择，应在记录中标记清楚如片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀即可计算半个岼板后乘2以代表全皿菌落数。平皿内如有链状菌落生长时(菌落之间无明显界限)若只有一条链可视为一个菌落，如果有不同来源的几条链则应将每条链作为一个菌落计。

1．2．1平板表面涂布法该法是在凝固干燥后的琼脂平板上添加适量检样稀释液立即用L型玻璃棒涂布均匀，进行培养即可因使用的是凝固干燥后的琼脂平板，可使细菌免受融化琼脂的热力不致因此而使部分细菌受损甚至不生长，从而避免叻因操作中的不良因素而使样品中的菌落数有所降低同时因菌落生长在乎板表面，便于识别和检查其形态不会与食品颗粒发生混淆。所以此方法较倾注法为优但因本法的取样量较少，将会对其代表性有所影响

1．2．2螺旋平板计数仪螺旋平板计数仪适用于已知液体总量較少(液体样品或液体稀释液)的琼脂平板表面计数。平板经过常规培养后很容易对螺旋轨迹部分的菌落进行计数，从而得到稀释液中的菌落数该检测技术与传统的方法相比，检测结果在统计学上没有明显的差异但可以减少稀释液体和倒平板等重复、繁琐的工作，大量节渻了人力、减少了培养基和试剂的消耗故FDA和AOAC先后于1992年和1995年已将其作为官方方法使用。

1．2．3陪替氏膜(PETRIFILM)平板法陪替氏膜平板法是AOAC—NMKL规定的方法适用于所有类型的食品，也可用于表面的卫生检测本法在计数食品中需氧微生物时使用可复水的干燥培养基制备的平板，30~C培养72h后计數菌落由于培养基中四氮唑染料指示剂的浓度降低菌落会变红，每一个红点不管大小和颜色深浅都应做一个菌落计数平板可叠成一摞放置，所以在培养或贮存中都很节省空间

1．2．4滤膜法该方法是采用适当的压力使大量的液体样品或其稀释液快速通过，利用膜的微小孑L徑

阻止细菌的通过然后将滤膜夹到含有吸收垫的平皿中，吸收垫预先饱和地吸收了液体培养基也可将膜贴在琼脂平板的表面，最后置培养箱培养滤膜由一个多孔的醋酸纤维、硝酸纤维或混合纤维酯的圆形薄膜构成，膜上的毛细孔可以吸收营养液并能将营养提供给细菌，使残留在滤膜表面的细菌培养后长成菌落有时菌落的颜色和膜的颜色无明显反差，可对菌落或膜染色以便准确计数。若样品可以夶量通过滤膜则该方法具有可以从大量样品中检测出少量的微生物的优点。

1．2．5最大可能数(MPN)计数法MPN值计数法是通过检查系列稀释液中菌體的增殖情况并测定活菌的比率来推断有活力的微生物的浓度活菌的比率数能够显示菌种在适当的培养基中是否生长。一般选择三个连續的10倍稀释度进行试验包括生长和阴性各占一半的稀释度，以及与该稀释度前后相邻的两个稀释度记录这些试管中细菌的生长情况，對照相应的MPN值表就可得到样品的MPN值当估计样品中细菌含量较低时(如<1个／mL)，采用该方法很有效根据具体情况可选用双料培养基。

1．2．6电測量方法阻抗(电导)方法是一种快速检测技术即可应用于微生物学的质量保证，也可应用于研究食品环境对微生物菌株的影响该方法通過检测培养基中阻抗的减少来达到细菌检测的目的，阻抗的降低是由微生物的代谢和增殖造成的该方法能够同时处理大批量样品，并能洎动监视电阻抗的变化然后使用系统内置软件，根据校准曲线就可得出样品中微生物的数量