1. 如何将不同构型的质粒DNA区别开？

答：由于不同构型的DNA在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率不同，ccc DNA的泳动速度最快，通过凝胶电泳方法可将不同构型的DNA区别开。

2.用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？

答：异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。

3.用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？

答：用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl 或 NaAc，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。

4.在提取RNA时经常使用异硫氰酸胍，有什么作用？

答：RNA是一种极易降解的核酸分子。高浓度强变性剂异硫氰酸胍使细胞结构迅速被破坏，使RNA从细胞中释放出来。同时高浓度异硫氰酸胍还使细胞内的RNA酶失活，使释放出的RNA不被降解。

5.蛋白印迹中封闭液的作用？

答：封闭液的作用是封闭未吸附蛋白的部位，以减少非特异性结合背景的影响。常用的封闭液有脱脂奶粉、小牛血清等。

6$DNA通常保存在什么缓冲液中？

答：采用TE缓冲液，Tris-HCl的缓冲系统，加入EDTA可以螯合二价金属离子进而抑制依赖于二价金属离子的DNA酶的活性，对DNA起到保护作用。

7$在酶切反应缓冲液中为什么加入BSA？

答：通过提高溶液中蛋白质的浓度，对酶起保护作用。

8$简单的克隆载体必需包括什么？

答：复制起点；选择标记：主要是抗性基因；多克隆位点：便于外源DNA的插入。

1.用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？使蛋白质变性。

2.在分离DNA时，要使用EDTA，为什么？ EDTA是金属离子螯合剂，螯合二价离子，抑制核酸酶的活性。

3.在分离DNA过程中，造成DNA分子断裂的因素有哪些？核酸酶降解；化学降解；物理剪切。

4.使用离心机应注意什么？

首先应该根据自己的实验需求选择合适的离心机和转子以及离心管，使用离心机时的工作转速不应该超过离心机、转子以及离心管的最大允许转速。离心前注意严格平衡样品。安装转子和转子盖要规范、准确。离心时要留人看守，发现离心机异常应立即关闭离心机。离心结束后要安放好转子。

5.分子生物学实验室常用的灭菌方法有哪些？

高压蒸汽灭菌、干热灭菌、化学药剂消毒、过滤除菌。

6.使用移液器有哪些注意事项？

垂直吸液、慢吸慢放；选择合适的量程范围，不能超过量程使用；选择与移液器匹配的枪头，安装枪头时不要用力太猛；移液器每日用完后，应旋到最大刻度

7．为什么要用pH8的Tris水溶液饱和酚？呈粉红色的酚可否使用？如何保存酚不被空气氧化？

因为酚与水有一定的互溶，苯酚用水饱和的目的是使其抽提DNA过程中，不致吸收样品中含有DNA的水分，减少DNA的损失。用Tris调节至pH为8是因为DNA在此条件下比较稳定。

保存在冰箱中的酚，容易被空气氧化而变成粉红色的，这样的酚容易降解DNA，一般不可以便用。为了防止酚的氧化，可加入疏基乙醇和8-羟基喹琳至终浓度为0.1％。8-羟基喹琳是带有淡黄色的固体粉末，不仅能抗氧化，并在一定程度上能抑制DNase的活性，它是金属离子的弱螯合剂。用Tris pH8.0水溶液饱和后的酚，最好分装在棕色小试剂瓶里，上面盖一层Tris水溶液或TE缓冲液，隔绝空气，以装满盖紧盖子为宜，如有可能，可充氮气，防止与空气接触而被氧化。平时保存在4℃或－20℃冰箱中，使用时，打开盖子吸取后迅速加盖，这样可使酚不变质，可用数月。

8．抽提DNA去除蛋白质时，怎样使用酚与氯仿较好？

酞与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。

作为表面变性的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约10％～15％的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA，而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走DNA。所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿混合(1:1)使用。

9．为什么用酚与氯仿抽提DNA时，还要加少量的异戊酵？

在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。一般采用氯仿与异戊酵为24：1之比。也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25：24:1(不必先配制，可在临用前把一份酚加一份24：1的氯仿与异戊醇即成)，同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。

10．为什么在保存或抽提DNA过程中，一般采用TE缓冲液？

在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。磷酸盐缓冲系统(pKa＝7.2)和硼酸系统(pKa=9.24)等虽然也都符合细胞内环境的生理范围(pH)，可作DNA的保存液，但在转化实验时，磷酸根离子的种类及数量将与Ca2＋产生Ca3(PO4)2沉淀；在DNA反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用Tris-HCl(pKa=8.0)的缓冲系统，由于缓冲液是TrisH+/Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCl系统，而TE缓冲液中的EDTA更能稳定DNA的活性。

1.电击杯为什么要放在冰上？感受态细胞也要放在冰上？

感受态细胞是指细胞容易吸收外源DNA的状态，这时的细胞壁是比较脆弱的，在实验前该细胞是放在-80度冰箱的，如果感受态细胞的温度骤然升高，那么细胞会膨胀破裂。冰为细胞提供了一个温度缓慢升高的过程，所以电击杯，感受态都要放在冰上。

2.载体的抗性基因是什么？平板上有什么？

载体的抗性基因是抗性基因bla，该基因特异性表达β-内酰胺酶，可以裂解抗生素的β-内酰胺环。在平板上是含有氨苄青霉素的，只有相应的含有bla基因并能表达产生β-内酰胺酶的菌才能存活。从而达到有目的筛选的目的。

3.电转与钙转的区别是什么？二者各有什么优缺点？

1）电穿孔法：靠脉冲电流在细胞膜上打孔而将核酸导入细胞。

缺点：需要昂贵的仪器（电穿孔仪）；对细胞的损伤较大，每次转染需要更多的细胞和DNA；每种细胞电转的条件都需要进行多次优化。

2）磷酸钙共沉淀法：磷酸钙有利于促进外源DNA与靶细胞表面结合，氯化钙+DNA+磷酸缓冲液按一定的比例混和，形成极小的磷酸钙-DNA复合物沉淀黏附在细胞膜表面，借助内吞作用进入细胞质。沉淀颗粒的大小和质量对于转染的成功至关重要。

优点：能用于任何DNA导入哺乳类动物，瞬时转染和稳定转染。

缺点：转染效率低：进入细胞的DNA只有１％－５％可以进入细胞核，其中只有不到１％的DNA可以与细胞DNA整合，在细胞中进行稳定表达。

重复性不佳：pH值、钙离子浓度、DNA浓度、沉淀反应时间、细胞孵育时间乃至各组分加入顺序和混合的方式都可能对结果产生影响。

4. 为什么在电转完毕之后，要把菌加到SOC中培养，而不是加到LB培养集中培养？

SOC的成分中含有单糖和丰富的无机盐离子，在LB培养基中含有酵母膏、蛋白胨等复杂的有机物。在刚刚转化完的细菌细胞内还没有完整的酶系统，不能利用复杂的有机物，所以要加SOC。

5. 电击时间是多少？电压为多少？

6.为什么要擦干电击杯上的水？

因为电击杯在电转之前是放在冰上的，上面粘上了水。如果不擦净电击杯上面的水会造成短路，达不到电击转化的效果。

7.为什么涂板培养之后，如果出现单菌落那么涂布就是成功的，而连成一片就是失败的？

因为单菌落就是单克隆，整个菌落的细菌都是一个细菌繁殖得到的，它们的遗传信息是相同的，这些菌要么都是阳性克隆，要么都是阴性克隆。如果连成一片之后，遗传信息不能保证完全一致，那么就无法鉴定是阳性克隆还是阴性克隆。

8、琼脂糖电泳如何进行鉴定质粒DNA.

多数情况下你能看到三条带，这三条带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和线性。如果你不小心在溶液II加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，是20-100kb的大肠杆菌基因组DNA的片断。非常偶然的是，有时候抽提到的质粒会有7－10条带，这是由于特殊的DNA序列导致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈数不同）所致。

9、传统的质粒提取方法步骤是什么

葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。

EDTA：(1)螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用(DNase作用时需要一定的金属离子作辅基)在溶液I中加入高达 10 mM 的EDTA，大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。

NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的。但当pH＞12或pH＜3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。在溶液II中的NaOH浓度为0.2mo1／L，加抽提液时，该系统的pH就高达12.6，因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。

SDS：SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有：(1)溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。(2)解聚细胞中的核蛋白。(3)SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R＋-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中(用RNase去除RNA时)受到干扰。

溶液III--3mol／LNaAc(pH4.8)溶液：使溶液回复中性，将基因组DNA、蛋白质等沉淀。

NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8，必须加入大量的冰醋酸。所以该溶液实际上是NaAc-HAc的缓冲液。用pH4.8的NaAc溶液是为了把pH12.6的抽提液，调回pH至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐的3mol／L NaAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SDS－蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。

第一章质粒DNA 的分离、纯化和鉴定
第二章DNA 酶切及凝胶电泳
第三章大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
第五章重组质粒的连接、转化及筛选
第六章基因组DNA 的提取
第八章聚合酶链式反应(PCR)扩增和扩增产物克隆

第一章质粒DNA 的分离、纯化和鉴定

　　 把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。细菌质粒是重组DNA 技术中常用的载体。

　　质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb 不等,为双链、闭环的DNA 分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常存活。质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。F 质粒(又称F 因子或性质粒)、R 质粒(抗药性因子)和Col 质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。

　　质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型(Stringent control)和松驰控制型(Relaxedcontrol)。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内只含有1 个或几个质粒分子,如F 因子。后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝,一般在20 个以上,如Col E1 质粒。在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时,细胞内蛋白质合成、染色体DNA 复制和细胞分裂均受到抑制,紧密型质粒复制停止,而松驰型质粒继续复制,质粒拷贝数可由原来20 多个扩增至 个,此时质粒DNA 占总DNA 的含量可由原来的2%增加至40-50%。

　　利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在,当两种质粒同时导入同一细胞时,它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争,在一些细胞中,一种质粒占优势,而在另一些细胞中另一种质粒却占上风。当细胞生长几代后,占少数的质粒将会丢失,因而在细胞后代中只有两种质粒的一种，这种现象称质粒的不相容性(Incompatibility)。但利用不同复制系统的质粒则可以稳定地共存于同一宿主细胞中。

　　质粒通常含有编码某些酶的基因,其表型包括对抗生素的抗性,产生某些抗生素,降解复杂有机物,产生大肠杆菌素和肠毒素及某些限制性内切酶与修饰酶等。

　　质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。与天然质粒相比,质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列,并去掉了大部分非必需序列,使分子量尽可能减少,以便于基因工程操作。大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列,这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA 序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：（1）分子量小、多拷贝、松驰控制型；（2）具有多种常用的限制性内切酶的单切点；（3）能插入较大的外源DNA 片段；（4）具有容易操作的检测表型。常用的质粒载体大小一般在1kb 至10kb 之间，如PBR322、PUC 系列、PGEM 系列和pBluescript（简称pBS）等。

　　从细菌中分离质粒DNA 的方法都包括3 个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞;分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁,十二烷基磺酸钠(SDS)和Triton X-100 可使细胞膜裂解。经溶菌酶和SDS 或Triton X-100 处理后,细菌染色体DNA 会缠绕附着在细胞碎片上,同时由于细菌染色体DNA 比质粒大得多,易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA 变性,而共价闭合环状DNA(Covalently closed circularDNA，简称cccDNA)的两条链不会相互分开，当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA 片段难以复性,而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起,而质粒DNA 双链又恢复原状,重新形成天然的超螺旋分子,并以溶解状态存在于液相中。

　　在细菌细胞内,共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中，除了超螺旋DNA 外，还会产生其它形式的质粒DNA。如果质粒DNA 两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链的张力,形成松驰型的环状分子,称开环DNA(Open circular DNA, 简称ocDNA)；如果质粒DNA 的两条链在同一处断裂,则形成线状DNA(Linear DNA)。当提取的质粒DNA 电泳时,同一质粒DNA 其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。

　　第二节材料、设备及试剂

　　微量取液器(20μl,200μl,1000μl)， 台式高速离心机，恒温振荡摇床， 高压蒸汽消毒器(灭菌锅)， 涡旋振荡器， 电泳仪，琼脂糖平板电泳装置和恒温水浴锅等。

2、LB 固体培养基：液体培养基中每升加12g 琼脂粉,高压灭菌。

10、饱和酚：市售酚中含有醌等氧化物,这些产物可引起磷酸二酯键的断裂及导致RNA 和DNA的交联,应在160℃用冷凝管进行重蒸。重蒸酚加入0.1％的8-羟基喹啉(作为抗氧化剂),并用等体积的0.5mol/L Tris?Cl (pH8.0)和0.1mol/L Tris?Cl(pH8.0)缓冲液反复抽提使之饱和并使其pH 值达到7.6以上,因为酸性条件下DNA 会分配于有机相。

11、氯仿:按氯仿:异戊醇＝24:1 体积比加入异戊醇。氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开,异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。按体积/体积＝1:1 混合上述饱和酚与氯仿即得酚/氯仿(1:1)。酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。

　　一、细菌的培养和收集
　　将含有质粒pBS 的DH5α菌种接种在LB 固体培养基(含50μg/ml Amp)中, 37℃培养12-24 小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB 液体培养基(含50μg/ml Amp)中,37℃振荡培养约12 小时至对数生长后期。

　　二、质粒DNA 少量快速提取
　　质粒DNA 小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA 十分有用。这些方法共同特点是简便、快速，能同时处理大量试样,所得DNA 有一定纯度,可满足限制酶切割、电泳分析的需要。

2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。
3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET 溶液中, 涡旋混匀。
5、将eppendorf 管放入沸水浴中,50 秒后立即取出。
6、用微量离心机4℃下12000g 离心10 分钟。
7、用无菌牙签从eppendorf 管中去除细菌碎片。
8、取20ml 进行电泳检查。
[注意] 1. 对大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取质粒DNA。
　　　2. 煮沸法中添加溶菌酶有一定限度,浓度高时,细菌裂解效果反而不好。有时不同溶菌酶也能溶菌。
　　　3. 提取的质粒DNA 中会含有RNA,但RNA 并不干扰进一步实验,如限制性内切酶消化,亚克隆及连接反应等。

2、弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。
3、菌体沉淀重悬浮于100μl 溶液Ⅰ中(需剧烈振荡),室温下放置5-10 分钟。
4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl, 盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf 管数次,以混匀内容物(千万不要振荡),冰浴5 分钟。
5、加入150μl 预冷的溶液Ⅲ,盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10 秒,使沉淀混匀,冰浴中5-10分钟,4℃下12000g 离心5-10 分钟。
6、上清液移入干净eppendorf 管中,加入等体积的酚/氯仿(1:1),振荡混匀,4℃下12000g 离心5分钟。
7、将水相移入干净eppendorf 管中,加入2 倍体积的无水乙醇,振荡混匀后置于-20℃冰箱中20分钟，然后4℃下12000g 离心10 分钟。
8、弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入1ml 70％乙醇洗沉淀一次,4℃下12000g 离心5-10 分钟。
9、吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,真空干燥10 分钟或室温干燥。
[注意] 1. 提取过程应尽量保持低温。
　　　2. 提取质粒DNA 过程中除去蛋白很重要,采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好,要将蛋白尽量除干净需多次抽提。
　　　3. 沉淀DNA 通常使用冰乙醇,在低温条件下放置时间稍长可使DNA 沉淀完全。沉淀DNA 也可用异丙醇(一般使用等体积),且沉淀完全,速度快,但常把盐沉淀下来,所以多数还是用乙醇。

　　Promega 公司的Wizard 少量DNA 纯化系统可快速有效的抽提质粒DNA,整个过程只需15 分钟。提取的质粒可直接用于DNA 测序、酶切分析和体外转录等。

　　该系统中所含试剂和柱子可以用于50 次1-3ml 质粒培养液的分离和纯化，试剂包括10ml 细胞悬浮液，10ml 细胞裂解液；10ml 中和液，50ml Wizard 少量DNA 纯化树脂，50ml 柱洗液（使用前加95%乙醇至120ml )和50 支Wizard 微型柱。

2、去除上清液，菌体细胞悬浮于200μl 细胞悬浮液中,充分混合,并移入eppendorf 管中。
3、加200μl 细胞裂解液, 颠倒离心管数次,直到溶液变清亮。
4、加200μl 中和液,颠倒离心管数次。
6、加1ml Wizard 少量DNA 纯化树脂,颠倒离心管数次以充分混匀。
7、取一次性注射器, 取出注塞,并使注射筒与Wizard 微型柱连接,用移液枪将上述混合液加入注射筒中,并用注塞轻推,使混合物进入微型柱。
8、将注射器与微型柱分开,取出注塞, 再将注射筒与微型柱相连,加入2ml 柱洗液,并用注塞轻推，使柱洗液进入微型柱。
9、取出微型柱置于eppendorf 管中,离心2 分钟以除去微型柱中的柱洗液。
10、将微型柱放在一个新eppendorf 管中，加50μl TE(或水)于微型柱中，静止1 分钟后，4℃下12000g 离心20 秒。
11、丢弃微型柱，将eppendorf 管中的质粒DNA 贮于4℃或-20℃冰箱。
[注意] 树脂使用前应充分混匀,如有结晶,可将树脂用25-37℃水浴处理10 分钟。

　　三、质粒DNA 的大量提取和纯化

　　在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA,为此需要大量提取质粒DNA。大量提取的质粒DNA 一般需进一步纯化,常用柱层析法和氯化绝梯度离心法。

1、取培养至对数生长后期的含pBS 质粒的细菌培养液250ml，4℃下5000g 离心15 分钟,弃上清,将离心管倒置使上清液全部流尽。
2、将细菌沉淀重新悬浮于50ml 用冰预冷的STE 中（此步可省略）。
3、同步骤1 方法离心以收集细菌细胞。
4、将细菌沉淀物重新悬浮于5ml 溶液I 中,充分悬浮菌体细胞。
5、加入12ml 新配制的溶液II, 盖紧瓶盖,缓缓地颠倒离心管数次,以充分混匀内容物,冰浴10 分钟。
6、加9ml 用冰预冷的溶液III, 摇动离心管数次以混匀内容物,冰上放置15 分钟,此时应形成白色絮状沉淀。
9、加入等体积的饱和酚/氯仿,振荡混匀,4℃下12000g 离心10 分钟。
10、取上层水相, 加入等体积氯仿,振荡混匀,4℃下12000g 离心10 分钟。
13、真空抽干沉淀，溶于500ml TE 或水中。
[注意] 1. 提取过程中应尽量保持低温。
　　　2. 加入溶液II 和溶液III 后操作应混和,切忌剧烈振荡。
　　　3. 由于RNA 酶A 中常存在有DNA 酶,利用RNA 酶耐热的特性,使用时应先对该酶液进行热处理(80℃ 1 小时),使DNA 酶失活。

　　碱法大量提取DNA 往往需要很长的时间.Promega 公司的Wiazrd 大量DNA 纯化系统既简单又快速,只需要离心和真空抽干,这个系统可以从500ml 培养液中在3 小时以内获得1mg 以上的高质量的质粒DNA(200-20000bp)。该系统不需要酚和氯仿抽提,纯化后的DNA 溶于水或TE 缓冲液中，不含任何盐份，可以直接用于DNA 序列分析和酶切反应，也可以用于在核酸酶抑制剂（如RNasin）存在的条件下进行体外转录反应等。

1、100-500ml 细胞培养液置离心管中, 22-25℃下5000g 离心10 分钟, 所得细胞沉淀充分悬浮于细胞悬浮液中。
2、加15ml 细胞裂解溶液并轻轻混合,可以反复倒置混合,但不能用涡旋振荡,细胞裂解完全时,溶液会变清,这一步需要20 分钟。
3、加15ml 中和溶液,立即反复倒置离心管数次，并使之混匀。
4、1℃离心15 分钟。
5、小心地将上清液吸出并移至一个新离心管中。
6、加0.5 倍体积的异丙醇,混合均匀, 1℃下离心15 分钟。
7、弃上清,悬浮DNA 沉淀于2ml TE 缓冲液中。这一步中也许有的沉淀不能溶解。
9、每一个样品,使用一支Wizard 大量柱子,柱子的头插在真空器上(Promega 产品,与此配套)。
10、将树脂/DNA 混合液转入柱子中,真空抽取树脂/DNA 混合液。
11、将树脂/DNA 混合液抽干后,加13ml 柱子洗脱溶液至离心管中, 对管底部的树脂/DNA 进行洗脱(柱子一边旋转一边加入洗脱液)，并加入柱子中。
12、真空抽干所加入的洗脱。
13、再加12ml 柱子洗脱液进柱子并抽干。
14、加入5ml 80％乙醇漂洗柱中的树脂, 柱子真空抽干后将柱子放入用户提供的离心管中,2500rpm(1300g)离心5 分钟。
15、取出柱子，真空抽干5 分钟,再将柱子放入系统中所提供的离心管中，2500rpm(1300g)离心5 分钟。
17、取出柱子,离心管中溶液即为提取的质粒DNA,可以直接放在离心管中,盖上盖子，储存在4℃或-20℃备用。
[注意] 1. 在使用之前,系统所提供的柱子洗脱液按1:1 加入125ml 95％乙醇。
　　　2. 纯化树脂必须混匀后再用.

　　碱法提取的质粒DNA 即使用RNA 酶处理,仍会含有少量RNA。当有些试验需无RNA 污染的DNA制品时,则需进行进一步纯化。一般常用Sepharose 2B 或Sepharose 4B 进行纯化,该方法具有快速,条件温和,重复性好,载体物质可以再利用等优点,因而已广泛用于质粒DNA 纯化。

3、待DNA 溶液完全进入柱内后立即在柱的上部连接含有0.1% SDS 的TE(pH8.0)贮液瓶。
4、以1ml 流出液为1 份进行收集。
5、对每一管测定其OD260 值,以确定哪些管中含有质粒DNA。通常质粒DNA 在柱上流出的第一个峰中。
6、合并所有含质粒的洗脱液,用等体积的酚/氯仿(1:1)抽提,4℃下12000g 离心2 分钟,将上层水相转入新管。
7、加入2 倍体积的冰冷无水乙醇，-20℃下沉淀10 分钟,然后4℃下12000g 离心10 分钟,弃去上清液。
8、沉淀加70%乙醇洗涤,4℃下12000g 离心10 分钟,弃去上清液。
9、沉淀真空抽干,重新溶于TE 或无菌水中。
[注意] 在装柱过程中,要防止柱床中出现断裂或气泡现象,要使界面保持平整。对新装成的柱,应用含0.1% SDS 的TE 平衡, 以使柱内的凝胶均匀。

1. 质粒的基本性质有哪些？
2. 质粒载体与天然质粒相比有哪些改进？
3. 在碱法提取质粒DNA 操作过程中应注意哪些问题？

第二章DNA 酶切及凝胶电泳

一. DNA 的限制性内切酶酶切分析
　　限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA 序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP 的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA 分子,然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA 的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4 至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3'),有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA 片段(如SmaⅠ:5'-CCC↓GGG-3');有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的DNA 片段称粘性未端, 如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。

　　DNA 纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大部分限制性内切酶不受RNA 或单链DNA 的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时,会影响其进一步使用,因此在吸取限制性内切酶时,每次都要用新的吸管头。如果采用两种限制性内切酶,必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液,则可同时水解。若需要不同的盐浓度,则低盐浓度
的限制性内切酶必须首先使用,随后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿抽提，加0.1 倍体积3mol/L NaAc 和2 倍体积无水乙醇，混匀后置-70℃低温冰箱30 分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。

　　DNA 限制性内切酶酶切图谱又称DNA 的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。在DNA 序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA 的无性繁殖、基因文库的构建等工作中，建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节，近年来发展起来的RFLP(限制性片段长度多态性)技术更是建立在它的基础上。

　　构建DNA 限制性内切酶图谱有许多方法。通常结合使用多种限制性内切酶，通过综合分析多种酶单切及不同组合的多种酶同时切所得到的限制性片段大小来确定各种酶的酶切位点及其相对位置。酶切图谱的使用价值依赖于它的准确性和精确程度。

　　在酶切图谱制作过程中，为了获得条带清晰的电泳图谱，一般DNA 用量约为0.5-1μg。限制性内切酶的酶解反应最适条件各不相同,各种酶有其相应的酶切缓冲液和最适反应温度(大多数为37℃)。对质粒DNA 酶切反应而言, 限制性内切酶用量可按标准体系1μg DNA 加1 单位酶,消化1-2 小时。但要完全酶解则必须增加酶的用量,一般增加2-3 倍,甚至更多,反应时间也要适当延长。

　　琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA 片段的标准方法。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA 片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, E 染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng 的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA 条带,用于以后的克隆操作。

　　琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA 片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp 至近50kb 的DNA 片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5-500bp)效果较好,其分辩力极高,甚至相差1bp 的DNA 片段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快,可容纳相对大量的DNA,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA 电泳。

　　琼脂糖主要在DNA 制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中,在中性pH 值下带负电荷的DNA 向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定:
　　线状双链DNA 分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA 分子量对数成反比，分子越大则再所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。
　　一个给定大小的线状DNA 分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA 电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA 分子的大小。分离小于0.5kb 的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb 的DNA 分子所需胶浓度为0.3-0.7%, DNA 片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。
3、DNA 分子的构象
　　当DNA 分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA 在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋DNA 移动最快,而线状双链DNA 移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA 带难以确定是质粒DNA 不同构象引起还是因为含有其他DNA 引起时,可从琼脂糖凝胶上将DNA 带逐个回收,用同一种限制性内切酶分别水解,然后电泳,如在凝胶上出现相同的DNA 图谱,则为同一种DNA。
　　在低电压时,线状DNA 片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA 片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb 的DNA 片段的分辨率达到最大,所加电压不得超过5v/cm。
　　荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强,还会使线状DNA 迁移率降低15％。
　　电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA 的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA 几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA 变性。

第二节材料、设备及试剂

　　λDNA: 购买或自行提取纯化; 重组pBS 质料或pUC19 质粒; EcoRI 酶及其酶切缓冲液: 购买成品; HindⅢ酶及其酶切缓冲液: 购买成品;琼脂糖(Agarose): 进口或国产的电泳用琼脂糖均可。

　　水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉或电炉,紫外透射仪,照相支架, 照相机及其附件。

　　1、5×TBE 电泳缓冲液：配方见第一章。
　　2、6×电泳载样缓冲液：0.25％ 溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于4℃。
　　3、溴化乙锭(E 溶液母液:将EB 配制成10mg/ml,用铝箔或黑纸包裹容器,储于室温即可。

　　1、将清洁干燥并经灭菌的eppendorf 管(最好0.5ml)编号,用微量移液枪分别加入DNA 1μg 和相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2μl,再加入重蒸水使总体积为19μl,将管内溶液混匀后加入1μl 酶液,用手指轻弹管壁使溶液混匀,也可用微量离心机甩一下,使溶液集中在管底。此步操作是整个实验成败的关键,要防止错加，漏加。使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。
　　2、混匀反应体系后,将eppendorf 管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上）,37℃水浴保温2-3 小时,使酶切反应完全。

　　2、胶液的制备：称取0.4g 琼脂糖,置于200ml 锥形瓶中,加入50ml 0.5×TBE 稀释缓冲液,放入微波炉里(或电炉上)加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀,此为0.8％琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。
　　3、胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏(宽约1cm)紧密封住。将封好的胶槽置于水平支持物上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm 左右的间隙。向冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(E 溶液使其终浓度为0.5μg /ml(也可不把EB 加入凝胶中,而是电泳后再用0.5μg/ml 的EB 溶液浸泡染色)。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧,待琼脂糖溶液凝后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内,使胶液形成均匀的胶层。倒胶时的温度不可太低,否则凝固不均匀,速度也不可太快,否则容易出现气泡。待胶完全凝固后拨出梳子,注意不要损伤梳底部的凝胶,然后向槽内加入0.5×TBE 稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。因边缘效应样品槽附近会有一些隆起,阻碍缓冲液进入样品槽中,所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液。
　　4、加样：取10μl 酶解液与2μl 6×载样液混匀,用微量移液枪小心加入样品槽中。若DNA 含量偏低,则可依上述比例增加上样量,但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要更换tip 头,以防止互相污染,注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。
　　5、电泳：加完样后,合上电泳槽盖,立即接通电源。控制电压保持在60-80V,电流在40mA 以上。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm 时,停止电泳。
　　6、染色：未加EB 的胶板在电泳完毕后移入0.5μg/ml 的EB 溶液中,室温下染色20-25 分钟。
　　7、观察和拍照：在波长为254nm 的长波长紫外灯下观察染色后的或已加有EB 的电泳胶板。DNA 存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩,以免损伤眼睛。经照相机镜头加上近摄镜片和红色滤光片后将相机固定于照相架上，采用全色胶片，光圈5.6,曝光时间10-120 秒(根据荧光条带的深浅选择)。
　　8、DNA 分子量标准曲线的制作：在放大的电泳照片上,以样品槽为起点,用卡尺测量λDNA 的EcoRⅠ和HindⅢ酶切片段的迁移距离,以厘米为单位。以核苷酸数的常用对数为纵坐标,以迁移距离为横坐标,在坐标纸上绘出连结各点的平滑曲线,即为该电泳条件下DNA 分子量的标准曲线。
　　9、DNA 酶切片段大小的测定：在放大的电泳照片上,用卡尺量出DNA 样品各片段的迁移距离,根据此数值,在DNA 分子量标准曲线上查出相应的对数值,进一步计算出各片段的分子量大小(若用单对数坐标纸来绘制标准曲线,则可根据迁移距离直接查出DNA 片段的大小)。反之,若已知DNA 片段的大小亦可由标准曲线上查出它预计的迁移距离。
　　10、DNA 酶切片段排列顺序的确定：根据单酶切,双酶切和多酶切的电泳分析结果,对照DNA 酶切片段大小的数据进行逻辑推理,然后确定各酶切片段的排列顺序和各酶切位点的相对位置。以环状图或直线图表示,即成该DNA 分子的限制性内切酶图谱。
[注意] 1.酶切时所加的DNA 溶液体积不能太大，否则DNA 溶液中其他成分会干扰酶反应。
　　　2、酶活力通常用酶单位（U）表示，酶单位的定义是：在最适反应条件下，1 小时完全降解1mglDNA 的酶量为一个单位，但是许多实验制备的DNA 不象lDNA 那样易于降解，需适当增加酶的使用量。反应液中加入过量的酶是不合适的，除考虑成本外，酶液中的微量杂质可能干扰随后的反应。
　　　3、市场销售的酶一般浓度很大，为节约起见，使用时可事先用酶反应缓冲液（1×）进行稀释。另外，酶通常保存在50%的甘油中，实验中，应将反应液中甘油浓度控制在1/10 之下，否则，酶活性将受影响。
　　　4、观察DNA 离不开紫外透射仪,可是紫外光对DNA 分子有切割作用。从胶上回收DNA 时,应尽量缩短光照时间并采用长波长紫外灯(300-360nm）,以减少紫外光切割DNA。
　　　5、EB 是强诱变剂并有中等毒性,配制和使用时都应戴手套,并且不要把EB 洒到桌面或地面上。凡是沾污了EB 的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。
　　　6、当EB 太多,胶染色过深,DNA 带看不清时,可将胶放入蒸馏水冲泡,30 分钟后再观察。

1. 如果一个DNA 酶解液在电泳后发现DNA 未被切动, 你认为可能是什么原因？
2. 琼脂糖凝胶电泳中DNA 分子迁移率受哪些因素的影响？

第三章大肠杆菌感受态细胞的制备和转化

　　在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob 基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。

　　转化(Transformation)是将外源DNA 分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。

　　转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA 分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA 分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。进入受体细胞的DNA 现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA 分子的受体细胞)。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2 和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2 法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2 法为使用更广泛。

　　为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素：
1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5α菌株的OD600 为0.5 时,细胞密度在5×107 个/ml 左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。
2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA 应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA 的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA 的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。1ng 的cccDNA 即可使50μl 的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA 溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。
3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。
4. 防止杂菌和杂DNA 的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA 酶或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率或杂DNA 的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。本实验以E.coli DH5a 菌株为受体细胞,并用CaCl2 处理,使其处于感受态,然后与pBS 质粒共保温,实现转化。由于pBS 质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr )，可通过Amp 抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入pBS，则在含Amp 的培养基上不能生长。能在Amp 培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了pBS。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。本实验以E.coli DH5a 菌株为受体细胞,并用CaCl2 处理,使其处于感受态,然后与pBS 质粒共保温,实现转化。由于pBS 质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr )，可通过Amp 抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入pBS，则在含Amp 的培养基上不能生长。能在Amp 培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了pBS。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。

第二节材料、设备及试剂

　　恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无菌工作台,低温冰箱, 恒温水浴锅, 制冰机, 分光光度计,微量移液枪。

　　 从LB 平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB 液体培养基中,37℃下振荡培养12 小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50 的比例接种于100ml LB 液体培养基中,37℃振荡培养2-3 小时至OD600 ＝0.5 左右。

二、感受态细胞的制备( CaCl2 法)
1、将培养液转入离心管中,冰上放置10 分钟,然后于4℃下3000g 离心10 分钟。
3、弃去上清,加入4ml 预冷含15%甘油的0.05mol/L 的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。
4、感受态细胞分装成200μl 的小份,贮存于-70℃可保存半年。

1、从-70℃冰箱中取200μl 感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上。
2、加入pBS 质粒DNA 溶液(含量不超过50ng,体积不超过10μl),轻轻摇匀,冰上放置30 分钟后。
3、42℃水浴中热击90 秒或37℃水浴5 分钟,热击后迅速置于冰上冷却3-5 分钟。
4、向管中加入1ml LB 液体培养基(不含Amp),混匀后37℃振荡培养1 小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr )。
5、将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Amp 的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24 小时。

对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA 溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB 平板上应没有菌落出现。
对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。

　　统计每个培养皿中的菌落数。
　　转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：
　　转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积
　　转化频率（转化子数／每mg 质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA 加入量(mg)
　　感受态细胞总数＝对照组２菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积
　　感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数
[注意] 本实验方法也适用于其它E.coli 受体菌株的不同的质粒DNA 的转化。但它们的转化效率并不一定一样。有的转化效率高，需将转化液进行多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板,而有的转化效率低,涂板时必须将菌液浓缩(如离心),才能较准确的计算转化率。