常用吸入制剂品种介绍分类通用名商品名规格图片特点用法用量其他β2受体激动剂沙丁胺醇万托林100μg×200喷短效，是急性发作的首选药。常用量:1~2喷，必要时q4～8h.极量:8喷/日持续时间：4~5h注意事项：易出现恶心，头痛、头晕、心悸、手指震颤。高血压和甲亢患者慎用，长期用药可形成耐药性，药效降低。特布他林喘康速0.25mg×200喷短效，作用与沙丁胺醇相当。常用量:1~2喷，必要时6喷极量:24喷/日持续时间：4~7h福莫特罗奥克斯(都宝)4.5μ×60吸长效，作用较沙丁胺醇强且较持久，用于维持治疗和预防发作，适于夜间哮喘发作。但糖尿病患者慎用。常用量:1~2喷，1~2次/日2~4喷，1~2次/日极量:8喷/日沙美特罗+丙酸氟替卡松舒利迭50μg/250μg×60吸长效β－激动剂/激素，不适用急性哮喘发作的患者。作用缓和且持久。不能口服。沙美特罗+丙酸氟替卡松（舒利迭准纳器）联合用药可相互增加疗效。常用量:1吸，bid吸入型糖皮质激素丙酸倍氯米松必可酮250μg×80喷本药因疗效慢，不宜用于哮喘急性发作。可作为治疗哮喘发作的间歇期及慢性哮喘的首选药。常用量:轻度：1~2喷/日;中度：2~4喷/日;重度：4~8喷/日极量：8喷/日T1/2: 5h注意事项：为防止呼吸道真菌或病毒感染及产生声音嘶哑，每次用药后，应及时漱口，不使药液残留于咽喉部。特点：以上三种药是局部作用强，吸收作用微弱的肾上腺皮质激素。伯克纳鼻喷剂50μg×80喷常用量: 2喷/鼻孔，2次/日1喷/鼻孔，3~4次/日极量: 8喷/日布地奈德普米克(都宝)0.1mg×200喷局部作用是丙酸倍氯米松的1.6-3倍,几乎无全身作用,对肾上腺素抑制作用更轻。常用量:吸入激素治疗:2~4吸,qd ，1~4吸，bid，慢性阻塞性肺病:4吸，bid,极量:8吸，bid宝益苏0.2mg×100喷同普米克(都宝)丙酸氟替卡松辅舒良鼻喷雾剂50μg×120喷早晨用药好，丙酸氟替卡松是生物活性更强的吸入剂。常用量:2喷/鼻孔，每早M胆碱受体拮抗剂异丙托溴胺爱全乐20μg×200喷短效，主要用于防治各种支气管哮喘。尤以年龄较大，并心血管疾病，对糖皮质激素类药物疗效差或不能耐受以及不能用β2受体激动剂者为宜。常用量:2喷，4次/日极量:12喷注意事项：有青光眼倾向，前列腺增生患者慎用，少数病人有口干和口苦感。噻托溴铵粉吸入剂思力华18微克（包装：10粒胶囊+1个HandiHaler?（药粉吸入器）吸入装置/盒）长效，特异性的，作用呈剂量依赖性，可持续24小时以上，局部（支气管）选择性的，在临床上成为慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者显著而长效的支气管扩张药。常用量:吸1胶囊，一日1次，胶囊不得吞服不应作为急性发作时用药，余同异丙托溴胺吸入装置的临床应用及比较1、什么才是理想的吸入装置①在各种吸入流速下，剂量输出至肺部的稳定性高；②粒子直径小(2-5微米)；③容易使用；④装置体积小，便于携带；⑤可用于不同剂量药物；⑦经济；⑧可计数。常见的吸入装置有：雾化吸入、定量吸入、干粉吸入。2、雾化治疗定义：雾化治疗是通过特制的气溶液发生装置，将水分和药物形成气溶胶的液体微滴或固体微粒，被吸入并沉积于呼吸道和肺泡靶器官，达到治疗疾病，改善症状的目的；同时雾化吸入也具有一定的湿化稀释气道分泌物的作用。雾化治疗的优点：①相对于全身给药，雾化治疗具有药物用量小、起效快的优势。②根据药物的不同具有稀化痰液、消除炎症、解除支气管痉挛、减轻喉头水肿、抗感染等作用，成为改善气道畅通的有效手段。雾化治疗的适应症：①痰液粘稠；②气道炎症性疾病；③气道阻塞性疾病；④喉部疾病；⑤其他需要经气道吸收给药的。雾化器(Nebulizer)的优点和不足优点不足使用方便，不需要病人的配合治疗费用较贵不含刺激物有动力要求而携带不方便吸入肺部的药量较高疗效受病人和装置的影响较大药物沉积时间长2、定量吸入器（metered dose inhaler, MDI）定义：定量吸入器是目前应用最广泛的吸入技术，MDI筒内含有加压混合物，包括抛射剂（主要是氟利昂CFC，HFA134a）、表面活性剂（减少颗粒聚集）和药物（仅占总量的1％）等。筒内压力为300～500kPa，阀门开放时混合物定量的射出，初始速度超过30m/s，直径>30μm。20ms内成雾，理想的微粒化药物颗粒直径在1～5μm。距喷口10cm处雾粒直径为1.4-4.3um，每次约有80％的药物撞击并沉积于口腔部，仅10－20％到达肺内的作用部位。常见的有舒喘灵、万托林喷雾剂，它们在COPD中的作用：迅速扩张气道，解除气道痉挛，3至5分钟起效，维持3至4小时，每次2至4喷，每天4至6次或按需使用，常见不良反应：头痛、震颤、神经紧张、心悸、血压上升、脸色潮红定量气雾剂吸入方法①拧开保护盖，并摇匀深呼气；②然后手持气雾剂，嘴唇合拢咬住喷嘴；③尽量深吸气，同时按动气雾剂的底部，释放一个定量。④闭气数秒钟，然后移开喷嘴，缓慢呼气。定量吸入剂的优点和不足优点不足使用方便，可随身携带使用抛射剂无需购置设备需要病人掌握吸入技术起效快药品的使用受限容易药物过量从临床工作中的调查和指导训练的过程来看,患者主要存在的问题是吸气动作不正确和吸气按压不同步。其原因可能有以下几个方面:(1) 病人对说明书不能正确理解,尤其是对吸气动作和吸气与按压同步不理解。患者门诊取药时,医生和药剂人员往往只是告诉患者用药前详细阅读使用说明,但病人对关键的技术环节还是不能完全理解掌握。(2) 医护人员自身对MDI 的使用技术掌握不熟练,对病人指导训练不够。MDI 吸入技术是患者进行吸入治疗必须掌握的,只有熟练掌握吸入技术和技巧,才能保证吸入疗法的效果。加强对患者进行MDI 等吸入装置、吸入技术的指导训练和卫生宣教,已经成为呼吸内科护理工作的重要组成部分。3、MD I + 储雾罐定义：即定量吸入器加储雾罐,它先将药物喷入储雾罐,然后通过患者反复多次吸气,将药物吸入肺内。储雾罐的缓冲,可防止喷雾散失而提高吸入药量和治疗效果,使吸入肺部的药液量增加到33% ,支气管解痉作用较常规MDI增强1倍,克服了单用MDI的不足,且明显减少了口咽部药物的沉积量,提高了用药安全度。使用MD I加储雾罐时,不能1次喷入多剂量药物,应喷入1次药物后深长呼吸4、5次或连续吸入30 s以上,然后间隔2～3 min后再进行下一次用药。吸药后必须漱口,以减少声嘶、口咽部真菌感染的发生率及吸药时产生静电的影响。储雾罐尤其适用于激素吸入治疗,用于各年龄患者,但4、干粉吸入器（dry power inhaler, DPI）干粉吸入器的种类以患者的吸气作为驱动力，常用装置有单剂吸入器、多剂吸入器。单剂量型干粉吸入器：旋转式吸入器（spin haler）使用前装胶囊，如沙普尔、思力华,噻托溴铵粉吸入剂。多剂量型干粉吸入器：碟式吸入器（disk haler）、都保系列、准纳器。与MDI相比，DPI不需要吸气动作与揿药动作的协调，但需要较高的吸入流量和吸气流速，因此病情严重和小儿在最大吸气压力较低时不宜应用DPI。单剂量的干粉吸入剂,每次使用前必须塞入一个明胶胶囊,这对于急性哮喘、视力较差、手抖、关节炎患者难以使用。舒利迭?准纳器?的使用方法1、打开：用一手握住外壳，另一手的大拇指放在拇指柄上，向外推动拇指直至完全打开。2、推开：握住准纳器?的吸嘴对着自己。向外推滑动杆--直至发出咔哒声。表明准纳器?已做好吸药的准备。在剂量指示窗口有相应显示，不要随意拨动滑动杆以免造成药物浪费。3、吸入：深呼气后将吸嘴放入口中。切记不要将气呼入准纳器里，从准纳器?深深地平稳地吸入药物。切勿从鼻吸入。然后将准纳器?口中拿出，继续屏气约10秒钟，4、关闭准纳器。将拇指放在手柄上，往后拉手柄，发出咔哒声表示准纳器已经关闭，滑动杆自动复位。吸完药后请漱口。干粉吸入的优缺点优点缺点携带方便适用的药物较少无需抛射剂容易产生局部刺激使用方便，易于掌握使用者需要一定的吸力疗效好药粉必须保持干燥哮喘急性发作的病人无法使用常用吸入制剂品种介绍常用吸入制剂品种介绍吸入装置的临床应用及比较 1、什么才是理想的吸入装置 ①在各种吸入流速下，剂量输出至肺部的稳定性高；②粒子直径小(2-5微米)；③容易使用；④装置体积小，便于携带；⑤可用于不同剂量药物；⑦经济；⑧可计数。 常见的吸入装置有：雾化吸入、定量吸入、干粉吸入。 2、雾化治疗 定义：雾化治疗是通过特制的气溶液发生装置，将水分和药物形成气溶胶的液体微滴或固体微粒，被吸入并沉积于呼吸道和肺泡靶器官，达到治疗疾病，改善症状的目的；同时雾化吸入也具有一定的湿化稀释气道分泌物的作用。 雾化治疗的优点：①相对于全身给药，雾化治疗具有药物用量小、起效快的优势。②根据药物的不同具有稀化痰液、消除炎症、解除支气管痉挛、减轻喉头水肿、抗感染等作用，成为改善气道畅通的有效手段。雾化治疗的适应症：①痰液粘稠；②气道炎症性疾病；③气道阻塞性疾病；④喉部疾病；⑤其他需要经气道吸收给药的。 雾化器(Nebulizer)的优点和不足 优点不足 使用方便，不需要病人的配合治疗费用较贵 不含刺激物有动力要求而携带不方便 吸入肺部的药量较高疗效受病人和装置的影响较大 药物沉积时间长 2、定量吸入器（metered dose inhaler, MDI） 定义：定量吸入器是目前应用最广泛的吸入技术，MDI筒内含有加压混合物，包括抛射剂（主要是氟利昂CFC，HFA134a）、表面活性剂（减少颗粒聚集）和药物（仅占总量的1％）等。筒内压力为300～500kPa，阀门开放时混合物定量的射出，初始速度超过30m/s，直径>30μm。20ms内成雾，理想的微粒化药物颗粒直径在1～5μm。距喷口10cm处雾粒直径为1.4-4.3um，每次约有80％的药物撞击并沉积于口腔部，仅10－20％到达肺内的作用部位。 常见的有舒喘灵、万托林喷雾剂，它们在COPD中的作用：迅速扩张气道，解除气道痉挛，3至5分钟起效，维持3至4小时，每次2至4喷，每天4至6次或按需使用，常见不良反应：头痛、震颤、神经紧张、常用免疫组化标记物精编版常用免疫组化标记物公司标准化编码 [QQX96QT-XQQB89Q8-NQQJ6Q8-MQM9N]常用免疫组化指标的意义 Ki-67为细胞增值的一种标记，在细胞周期G1、S、G2、M期均有表达，G0期缺如，其和许多肿瘤分化程度、浸润、转移、预后密切相关。PCNA(增埴细胞核抗原)。 多数腺癌表达CEA Rb (retinoblastoma视网膜母细胞瘤) 基因是肿瘤抑制基因，调节细胞周期。 P53在免疫组化中均为突变型，阳性率越高，预后约差。野生型半衰期很短 Nm23是转移抑制基因，其阳性表达和肿瘤转移呈负相关。 E-Ca，E钙粘附蛋白，介导细胞间粘连作用的跨膜糖蛋白，其功能丧失引起细胞之间连接的破坏，主要用于肿瘤侵袭和转移方面的研究。 PS2（雌激素调节蛋白），其表达和ER表达有关，可作为内分泌治疗和预后判断的指标之一。 CK18，低分子量角蛋白，主要标记各种单层上皮包括腺上皮，而复层鳞状上皮常阴性，主要用于腺癌诊断。 CK19，分布于单层上皮和间皮，常用于腺癌诊断，肝细胞不表达，而胆管为阳性反应 Hep par 1,肝细胞抗原，正常肝细胞和高分化肝细胞癌阳性，低分化肝细胞癌多弱阳性或阴性。 CK20，用于胃肠道腺癌、卵巢黏液性肿瘤、皮肤Merkel细胞癌诊断。鳞癌、乳腺癌、肺癌、子宫内膜和卵巢非黏液性肿瘤常阴性。 CK7 卵巢、肺和乳腺上皮常阳性，结肠、前列腺、胃肠道上皮阴性。 Villin 绒毛蛋白，正常组织中，villin通常只表达于有刷状缘的细胞上，如胃肠道上皮细胞、胰腺和胆管上皮细胞以及肾实质的上皮细胞中（特别是近曲小管）。Villin在胃肠道癌、胰腺癌、胆囊癌和胆管癌组织中有很高的表达率，具有明显腺样结构的肿瘤上没有villin表达，则这个肿瘤为胃肠道、胰腺、胆囊或胆管来源的可能性极低。 乳腺癌也经常成为女性患者未知原发部位转移癌要鉴别排除的一种疾病。因为在转移癌组织上观察到明显的villin免疫组化阳性染色，则这个肿瘤就极吸入制剂与合理使用执业药师继续教育考试答案吸入制剂与合理使用执业药师继续教育考试答案 单选题（共10 题，每题10 分） 1 . 吸入治疗的优势包括（） ? A.肺部吸收面积大 ? B.见效快 ? C.药物从肺泡移到血液的距离短 ? D.以上都对 我的答案：D 参考答案：D 答案解析：暂无 2 . 气溶胶的具有（），有利于药物与气道表面黏膜上皮细胞接触而发挥药效 ? A.巨大的颗粒 ? B.巨大的接触面 ? C.巨大的气味 ? D.以上都对 我的答案：B 参考答案：B 答案解析：暂无 3 . 吸入疗法是目前（）中首选的给药方法。 ? A.哮喘治疗 ? B.流脑治疗 ? C.消化道感染治疗 ? D.以上都不对 我的答案：A 参考答案：A 答案解析：暂无 4 . 雾化吸入疗法是在在动力源的驱使下，液体药物被雾化成（），自然呼吸直接达到患病部位? A.超大的雾状颗粒 ? B.细微的雾状颗粒 ? C.干粉颗粒 ? D.以上都对 我的答案：B 参考答案：B 答案解析：暂无 5 . 气雾剂处方组成包含药物，还可以有（）等辅料。? A.抛射剂 ? B.表面活性剂 ? C.助溶剂 ? D.以上都对 我的答案：D 参考答案：D 答案解析：暂无 6 . 压力定量气雾吸入器(pMDI)的不足包括 ? A.口咽部药物沉积量较高 ? B.吸入技巧不易掌握 ? C.可造成支气管痉挛 ? D.以上都对 我的答案：D 参考答案：D 答案解析：暂无 7 . 关于pMDI+Spacer（加储物罐）的优点的正确描述是 ? A.吸入技巧不易掌握 ? B.吸入肺内的药量可达单用pMDI的一倍以上 ? C.装置明显大于pMDI ? D.抛射剂对环境有影响 我的答案：B 参考答案：B 答案解析：暂无 8 . 雾化治疗与患者相关的影响因素包括（） ? A.肺的解剖结构 ? B.疾病的状况 ? C.配合协同能力 ? D.以上都对 我的答案：D 参考答案：D 答案解析：暂无 9 . 雾化治疗专家共识推荐意见，肺内沉积的气溶胶大小最佳范围为? A.1～5μm ? B.1～5mg ? C.1～5ml ? D.以上都不对免疫组化操作方法原理步骤以及常见问题处理大总结免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结 1、方法操作不难，最大的难处是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化实验原理，每一步知道为什么这样做，这样你才敢大胆地改革先前的不对的方法步骤。如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。就拿温度来说，可以有4度、室温、37度，我推荐4度最佳，反应最温和，背景较浅；而37度反应速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。 2、免疫组化最大的优势是定位和定性。相比于其他蛋白检测方法，免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确，是定位检测分析首选方法。尤其对于有些因子的转位研究十分有用。 3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。 4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用PBS或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。 5、免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一。如今发SCI论文时，明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分欢迎，可能是怕你学术造假吧。当然也不能做假阳性或假阴性结果。 6、免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟的反应条件、浓度、方法步骤，重复运用于同一性质的切片和同一种抗体，做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法，更换一种抗体后，居然连二抗的种属来源都拿错了。失败往往促进你去思考试验原理和过程，成功有时也加快你自傲。 7、实验方法需要动手+动脑。如今我还不敢说我在免疫组化什么都知道。我只所以今天敢在这里说这说那，这是因为我经过了反复的动手+动脑，把理论原理运用于实践，在把实践中发现的问题带到理论知识中去解决，最终把理论与实践融会贯通。 一、概念和常用方法介绍 1、定义用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。 2、原理根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。 3、分类 1）按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。2）按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。3）按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是比较细胞免疫组化常用试剂配制免疫细胞化学常用试剂 一、固定剂 大多数神经激素、肽类物质为水溶性，在用于免疫细胞化学研究之前，常需固定。但肽类和蛋白质的物理、化学性质不同，因而对不同的固定方法或固定剂的反应也不尽相同。某些固定剂甚至可同时破坏和/或保护同一抗原的不同抗原决定簇。因此，在进行免疫细胞化学研究之前，很有必要了解所要研究的物质（蛋白质或肽类）的化学性质，并根据需要来选择适宜的固定剂（或固定方法）以及改进固定条件。 目前，免疫细胞化学研究中常用的固定剂仍为醛类固定剂，其中以甲醛类和戊二醛最为常用。在此，简要介绍几种目前较为常用和推荐的固定剂，以供读者选用。 1.4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.3） 试剂：多聚甲醛40g 0.1mol/L磷酸缓冲液至1000ml 配制方法：称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入500～800ml 0.1mol/L 磷酸缓冲液（Phosphate Buffer以下简称PB），加热至60℃左右，持续搅拌（或磁力搅拌）使粉末完全溶解，通常需滴加少许1n NaOH才能使溶液清亮，最后补足0.1mol/L的PB于1000ml，充分混匀。 该固定剂较适于光镜免疫细胞化学研究，最好是动物经灌注固定取材后，继续浸泡固定2～24h。另外，该固定剂较为温和，适于组织标本的较长期保存。 2.4%多聚甲醛-磷酸二氢钠/氢氧化钠 试剂：A液：多聚甲醛40g 蒸馏水400ml B液：Na2HPO4·2H2O16.88g 蒸馏水300ml C液：NaOH 3.86g 蒸馏水200m配制方法：A液最好在500ml的三角烧瓶中配制（方法同前），至多聚甲醛完全溶解后冷却待用。注意，在溶解多聚甲醛时，要尽量避免吸入气体或溅入眼内。B液和C液配制好后，将B液倒入C液中，混合后再加入A液，以1n NaOH 或1N HCl 将pH调至7.2～7.4，最后，补充蒸馏水至1000ml充分混合，4℃冰箱保存备用。 该固定剂适于光镜和电镜免疫细胞化学研究，用于免疫电镜时，最好加入少量新鲜配制的戊二醛，使其终浓度为0.5%～1%。该固定剂较温和，适于组织的长期保存。组织标本于该固定液中，4℃冰箱保存数月仍可获得满意的染色效果。 3．Bouin’s液及改良Bouin’s液 试剂：饱和苦味酸 40%甲醛250ml 冰醋酸50ml 配制方法：先将饱苦味酸过滤，加入甲醛（有沉淀者禁用），最后加入冰醋酸，混合后存于4℃冰箱中备用。冰醋酸最好在临用前加入。改良Bouin’s液即不加冰醋酸。 该固定液为组织学、病理学常用固定剂这一，对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整。但因偏酸（pH为3～3.5），对抗原有一定损害，且组织收缩较明显，故不适于组织标本的长期保存。此外，操作时，应避免吸入或与皮肤接触。 4．Zamb oni’s(Stefanini’s)液 试剂：多聚甲醛20g 饱和苦味酸 150ml Karasson-Schwlt’s PB至1000ml 配制方法：称取多聚甲醛20g，加入饱和苦味酸150ml，加热至60℃左右，持续搅拌使充分溶解、过滤、冷却后，加Karasson-Schwlt’s PB至1000ml充分混合（Karasson –Schwlt’s磷酸缓冲液的配制配制方法见后）。 该固定液适于电镜免疫细胞化学，对超微结构的保存较纯甲醛为优，也适于光镜免疫细胞化学研究，为实验室常用固定剂之一。我们在应用中，常采用2.5%的多聚甲醛和30%的饱和苦味酸，以增加其对组织的穿透力和固定效果，保存更多的组织抗原。固定时间为6～18h。 5．PLP液PLP液即过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛固定液 （Periodate-Lysine-paraform-alde－hyde fixative）免疫组化入门实验操作免疫组化入门实验操作 一、实验目的： 1.了解免疫组化基本原理。 2.了解免疫组化实验操作及注意事项。 3.免疫组化结果判定。 通过实验，让学生熟悉免疫组化操作流程及注意事项，对抗原抗体结合、抗原修复和酶催化底物显色进行研究。要求学生通过查阅文献，在归纳、对比、总结的基础上对免疫组化有进一步的了解。 二、实验原理： 三、实验材料： 一抗：CD5、CK8、Ki67 二抗：MaxVision3 其它：柠檬酸抗原修复液、过氧化物酶阻断剂、PBS缓冲液、DAB、孵育盒、染色架、苏木素、盖玻片、冲洗瓶、中性树胶，孵育盒。 四、实验步骤：1.脱蜡水化 二甲苯5min，二甲苯5min，二甲苯5min，无水乙醇2min，无水乙醇2min，95%酒精2min，85%酒精2min，自来水冲洗。 2.抗原修复 高压锅中加入1200mL柠檬酸修复液，电磁炉煮沸后放入切片，扣紧锅盖，功率调至800W，至压力阀均匀喷气后计时 1.5min，移开高压锅室温冷却10min，自来水冷却。 3.过氧化物酶阻断 修复结束后，流水冲洗干净，除去自来水，在离组织3mm处用免疫组化油笔画圈或用纸巾擦干组织外残留的液体，滴加50 μL（一滴）过氧化物酶阻断剂，室温孵育10min，PBS冲洗3×3min。 4.一抗 甩去PBS，纸巾擦干组织3mm外的残留液体，每张切片加50 μL（一滴）相应一抗，室温下孵育60分钟，PBS冲洗3×3min。 5.二抗 甩去PBS，纸巾擦干组织3mm外的残留液体，每张切片加50 μL（一滴）MaxVisionTM试剂，室温下孵育30分钟，PBS冲洗3×3min。 6.DAB 甩去PBS液，纸巾擦干组织3mm外的残留液体，每张切片加50 μL（一滴）新鲜配制的DAB，显色5分钟，自来水冲洗。 7.苏木素复染 每张切片滴加50 μL（一滴）苏木素，20-30秒后自来水冲洗30s以上，或浸泡于PBS中30s以上再自来水冲洗。 8.封片 梯度酒精脱水干燥（85%酒精2min，95%酒精2min，无水乙醇2min，无水乙醇2min，二甲苯1min），或直接电吹风吹干，中性树胶封固。常用的雾化吸入药物常用的雾化吸入药物 临床上，常用的雾化吸入药物有3类： (1)湿化祛痰剂： 粘液脓栓或粘稠分泌物是气道阻塞的常见原因，并常使肺功能损害加重，诱发感染，这类药物主要作用是化痰，以利于痰液排出。生理盐水5ml，用于湿化气道；α-糜蛋白酶 2.5～5mg加生理盐水10ml稀释后应用；2%～4 %碳酸氢钠2～5ml；蒸馏水5ml；必嗽平2ml加生理盐水5ml稀释后应用，同时加入支气管扩张剂。 (2)支气管扩张剂： 常用于咳喘患儿。如异丙肾上腺素 0.25～ 0.5mg加生理盐水5～10ml稀释； 0.5%舒喘灵 0.01～ 0.03ml/kg·次，加生理盐水10ml稀释；地塞米松2mg加生理盐水5～10ml 稀释。 (3)抗生素： 雾化吸入在止咳化痰的同时一般都加入抗生素控制炎症，因为许多患儿的咳嗽，咳痰都与感染有关。常用药物： 青霉素5～10ml次，加入生理盐水5～10ml皮试后应用；庆大霉素2万μ～4万μ/次加生理盐水10ml；红霉素 0.15～0.3g/次加生理盐水10ml稀释；制霉菌素2～3万μ/次加生理盐水10ml稀释。 通常，上述三类药物同时应用效果较好。临床常用： α-xx 2.5～5mg，地塞米松2～5mg，庆大霉素4万μ～8万μ，加入生理盐水10～20ml以达到祛痰、平喘、消炎的功效。 雾化药物基本组方： 庆大霉素4~8万u，地塞米松5~10 mg，α-糜蛋白酶5mg，对于喉水肿严重并出现呼吸困难者加入肾上腺素 0.5~1mg，并加大地塞米松用量。将上述药物用40℃温开水配成15 ml加入雾化杯中，机器水槽内加50℃的温开水进行超声雾化吸入。急性喉炎每日吸2次;每次10~20min，5天为1个疗程，应用1~2个疗程;慢性喉炎每日1次，每次20min，7天为1个疗程，应用2~4个疗程。每个疗程间可有2~3天休息。具体需要到医院检查后再制定治疗方案。 选用超声雾化吸入药物时应注意哪些问题？ 超声雾化吸入应用的各种药物，必须是水溶性的，稳定性好、粘稠度低及适宜人体组织的胶体渗透压；药液浓度太高不易起雾；药液对粘膜不宜有刺激性；酸碱度要接近中性；注意不要引起过敏反应。雾化的药液应新鲜配制，定期消毒，避免污染。 用作雾化治疗的液体可选用蒸馏水、０．４５％盐水或生理盐水。蒸馏水稀释粘液的作用较生理盐水强，但刺激性也较强，因此，当分泌物较粘稠干涸时，可选用蒸馏水或０．４５％盐水，长期湿化则可用生理盐水。心脏功能不全者，长期使用生理盐水湿化时应注意对心脏负荷增加的影响。 超声药物雾化吸入疗法 超声雾化吸入疗法系气雾吸入疗法的一种。是利用超声的空化作用，使液体在气相中分散，将药液变成雾状颗粒（气溶胶），通过吸入直接作用于呼吸免疫组化试剂免疫组化 免疫组化是组织化学的一种，它是利用已知的特异性抗体或抗原能特异性结合的特点，通过化学反应使标记于结合后的特异性抗体上的显示剂，如酶、金属离子、同位素等，显示一定的颜色，并借助显微镜观察其颜色的变化，从而在抗原抗体结合部位确定组织、细胞结构的化学成份或化学性质。 免疫组化试剂盒： Vector Laboratories公司VECTASTAIN@ ABC免疫组化试剂盒： Vector公司于1977年率先开发出了生物素-亲和素系统，该产品系列是检测方法上的重要革命。其后，公司发展出ABC技术（Avidin : Biotinylated Enzyme Complex Technology，亲和素-生物素-过氧化物酶复合物技术），并建立了著名的VECTASTAIN?ABC系统，目前，该系统被视为最灵敏、最可靠与最有效的染色系统，并被广泛应用于免疫组织化学、免疫电镜、原位杂交与凝集素化学中。ABC技术利用生物素和卵白素具有极高亲和性的生物学特征，将卵白素和生物素化辣根酶按照一定的比例混合，形成ABC复合物。该法亦被称作三步法，第一步为biotin化二抗和一抗结合，第二步为avidin（亲和素，A液）和二抗上的biotin结合，第三步为HRP偶联的biotin（B液）和avidin结合，而HRP再催化底物显色完成染色。试剂盒组份： 2ml试剂A（Avidin DH溶液） 2ml试剂B（生物素化的酶） 1ml生物素化的二抗（1.5mg anti-IgG/0.5mg anti-IgM抗体/2.1mg通用抗体） 3ml阻断血清 其中standard试剂盒只含有试剂A和试剂B VECTASTAIN?ABC系列产品 VECTASTAIN?ABC-HRP Kits（辣根过氧化物酶）最通用的系统，使用范围广VECTASTAIN?ABC-AP Kits（碱性磷酸酶）灵敏度较高，染色密度较低，适于形态学染色非常重要的组织 VECTASTAIN?ABC-GO Kits（葡萄糖氧化酶）灵敏度较低，适用于组织内源性HRP或AP 含量比较高的组织，常与HRP或AP系统配合进行双染。 VECTASTAIN?ABC Kits（辣根过氧化物酶）灵敏度高，特别适用于神经组织免疫组化实验步骤免疫组化实验步骤 Revised final draft November 26, 2020石蜡切片免疫组化实验步骤 石蜡切片步骤按照晓峰整理的步骤进行（From徐晓峰、朱老师的“石蜡切片”方案）： 1）材料的准备 在本实验室条件下推荐使用FAA（50%ethanol,5%aceticacid,3.7%甲醛）固定材料。 FAA固定液（100ml），室温保存： 无水乙醇50ml 冰醋酸5ml 37%甲醛10ml 水35ml 第一天：组织固定 用FAA固定，详见“石蜡切片”protocol。 第二天：脱水 以上所有步骤中每换好一步乙醇均置于4℃冰箱等待，并不时轻摇。 *组织可在70%ethanol4℃可存放几个月 第三天：进一步脱水和浸蜡 以下所有步骤在4℃进行并不时轻摇以下所有步骤在室温进行并不时轻摇 准备工作：60℃预热plus蜡片（ParaplastPlus）石蜡可反复融凝而去气泡 第四天：浸蜡2 将材料置于42℃直至蜡块完全熔化。再加1/4体积的蜡块至完全熔化后移至60℃。几个小时后换上新鲜熔好的蜡液，过夜。 第五天：浸蜡3 换蜡两次（ParaplastPlus） 第六天：浸蜡4 换蜡两次（ParaplastPlus） 第七天：浸蜡5 换蜡两次（ParaplastPlus） 准备工作：60℃预热Regular蜡片（ParaplastRegular）第八天：包埋（包埋块可长久保存） 第九天及之后： 开始切片，切片应包括自己的片子及正负对照等。事先打开烘片机至37度，在涂有多聚赖氨酸的玻片上加1~2ml的蒸馏水。切好的片子轻至于加水的玻片上。待所有片子准备完之后盖上盖子，烘片过夜。 用自来水及双蒸水清洗免疫组化专用塑料，放在烘箱烘干待用。 第二天：开始脱蜡（From徐晓峰、朱老师整理的“石蜡切片”protocol） （用新买来的免疫组化塑料小盒，每一步只需加入试剂220~250毫升） 抗原修复： 在切片还浸入酒精时，可以事先将煮锅清洗干净，用蒸馏水洗1~2遍，最后加入0.01M柠檬酸钠缓冲液(PH=6.0)，煮沸(保持在95度左右)，将过完PBS的片子让入煮沸的锅中，煮片10~15min。然后将电磁炉关闭，自然冷却锅中切片（千万不要把片子拿出来，放在缓冲液中一起自然冷却至室温！！！） 将片子浸入PBS（PH=7.4）5min。各种吸入剂的正确使用方法各种 吸入 剂的 正确 使用 方法 使用气雾剂吸入治疗是治疗哮喘的有 效方法之一，吸入治疗的效果与吸入装置及正确的使用方法有关，现将常用吸入装置及正确使用方法作一介绍 1.压力定量气雾吸入器 压力定量气雾吸入器压力定量气雾吸入器是由药物、推进剂、表面活性物质或润滑剂三种成分组成。使用此种吸入装置的气雾剂有万托林气雾剂、喘康速气雾剂、爱全乐气雾剂、必可酮气雾剂、辅舒酮气雾剂、普米克气雾剂等。使用方法为：①移去套口的盖，使用前轻摇贮药罐使之混匀。②头略后仰并缓慢地呼气，尽可能呼出肺内空气。③将吸入器吸口紧紧含在口中，并屏住呼吸，以食指和拇指紧按吸入器，使药物释出，并同时做与喷药同步的缓慢深吸气，最好大于5秒钟（有的装置带笛声，没有听到笛声则表示未将药物吸入）。4尽量屏住呼吸5～10秒钟，使药物充分分布到下气道，以达到良好的治疗效果。⑤将盖子套回喷口上。⑥用清水漱口，去除上咽部残留的药物。 2.干粉吸入器 干粉吸入器是通过使用者主动吸入空气的动能分散药物微粒，干粉雾颗粒的流速与使用者的吸气流速相吻合。国内常用的干粉吸入器有两种：储存剂量型涡流式干粉吸入器，俗称都保，如普米克都保、奥克斯都保。另一种为为准纳器，如舒利迭。 都保的使用方法：①旋转并移去瓶盖。检查剂量指示窗，看是否还有足够剂量的药物。②③一手拿都保，另一手握住底盖，先向右转到底再向左转到底，听到“咔”一声，即完成一次剂量的充填。④⑤吸入之前，先轻轻地呼出一口气（勿对吸嘴吹气），将吸嘴含于口中，并深深地吸口气，即完成一次吸入动作。深吸气的目的：是要让药粉可以深入肺部达到良好的治疗效果。吸药后，从嘴唇移走吸入瓶，约屏气5～10秒，然后缓缓呼气。⑥用完后将瓶盖盖紧。注意事项：①10分钟后，用温水漱口以保持口腔清洁。②清理吸嘴：用手握住吸嘴往外压，即可把吸嘴拿下，用干布把吸嘴下方内侧之药粉擦干净，绝对不可以用水清洗。 准纳器的使用方法：①一手握住准纳器外壳，另一手拇指向外推动准纳器的滑动杆直至发出咔哒声，表明准纳器已做好吸药的准备。②握住准纳器并使远离嘴，在保证平稳呼吸的前提下，尽量呼气。③将吸嘴放入口中，深深地平稳地吸气，将药物吸入口中，屏气约10秒钟。④拿出准纳器，缓慢恢复呼气，关闭吸入制剂质量控制研究技术指导原则汇总附件一 吸入制剂质量控制研究技术指导原则吸入制剂质量控制研究技术指导原则 一、概述 吸入制剂系指通过特定的装臵将药物以雾状形式传输至呼吸道和/或肺部以发挥局部或全身作用的制剂。与普通口服制剂相比，吸入制剂的药物可直接达到吸收或作用部位，吸收或作用快，可避免肝脏首过效应、减少用药剂量；而与注射制剂相比，可提高患者依从性，同时可减轻或避免部分药物不良反应。因而近年来越来越为药物研发者所关注。 吸入制剂在制剂处方、给药装臵、制剂工艺、质量研究、稳定性研究等方面均有其特殊关注点，可对吸入制剂的质量可控性、安全性与有效性产生至关重要的影响，因此质量控制研究部分是吸入制剂的临床前乃至临床研究重点之一。 本指导原则是在参考国内外相关指导原则和文献的基础上，结合我国吸入制剂研发的现状，通过分析质量控制研究与安全有效性和质量可控性之间的内在关系而制定的。旨在为药物研发者在吸入制剂质量控制研究过程提供基本的技术指导，也力求使药物研发者和评价者对药物评价过程中需要关注的问题达成共识。 本指导原则所讨论内容仅限于经口腔吸入制剂在质量控制研究工作方面的特殊研究内容，经鼻吸入制剂暂不纳入本指导原则。其他一般性要求参见国家食品药品监督管理局颁布的相关指导原则。 由于新制剂技术的不断涌现以及临床上的特殊需求，在吸入制剂研发过程中会遇到很多难以预料的问题，因此本指导原则只是一个一般性原则，药物研发者应从药物研发的客观规律出发，具体问题具体分析，必要时根据实际情况采用其他有效的方法和手段进行研究。本指导原则适用于吸入制剂研发的整个过程。 二、吸入制剂的分类 根据处方、制剂工艺的不同，吸入制剂表现出多种制剂形式，目前国内外有多种剂型名称并存，相互之间既有交叉也有覆盖，不利于药物研发和评价。为此，本指导原则从分类的科学性出发，同时参考国内外指导原则和相关文献，将吸入制剂分为气雾剂、喷雾剂和粉雾剂，以便有针对性地提出各自的质量控制要求。需要说明的是，多数疾病均需定量给药，因此本指导原则所涉及内容均以定量吸入制剂为对象。 气雾剂系指将含药溶液、乳状液或混悬液与适宜的抛射剂共同分装于具有特制阀门系统的耐压容器中，使用时借助抛射剂的压力将内容物成雾状喷出，吸入后发挥局部或全身治疗作用。气雾剂一般由药物、辅料、耐压容器、定量阀门系统和喷射装臵组成。 喷雾剂系指含药溶液、乳状液或混悬液臵于特制的装臵，使用时借助适当的雾化系统将内容物呈雾状释出，用于患者吸入的制剂。喷雾剂一般由药物、辅料、容器、雾化装臵等组成。 粉雾剂系指将微粉化的药物或/和载体以单剂量或多剂量储库形式，采用特制的干粉吸入装臵，由患者主动吸入雾化药物至呼吸道或肺部的制剂。 三、质量控制研究 （一）吸入制剂质量控制的主要指标和参数 根据吸入制剂的制剂特点以及临床应用特点，气雾剂、喷雾剂和粉雾剂的质量控制指标/参数主要有药物/雾滴的粒度和粒度分布、喷射模式、每揿主药含量/每喷主药含量/每吸主药含量、每瓶总揿次/每瓶总喷次/每瓶总吸次，在吸入制剂的处方工艺研究、质免疫组化技术(原理、分类、步骤及主要试剂、设备准备)免疫组化技术 原理 抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。 众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原 - 一抗 - 二抗复合物，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。 分类（常用） 1、免疫荧光方法 最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较广。 2、免疫酶标方法 免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60年代发展起来的技术。基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标技术是目前定位准确、对比度好、染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。免疫酶标方法的发展非常迅速，已经衍生出了多种标记方法，目前在病理诊断中广为使用的当属PAP法（过氧化物酶-抗过氧化物酶）、ABC法（卵白素-生物素-过氧化物酶复合物）、SP 法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶）、即用型二步法（聚合物链接）等。 3、免疫胶体金技术 免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。胶体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白的生物学活性则没有明显的影响。因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌A蛋白)等作为探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以免疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。由于胶体金本身呈淡至深红色，因此也适合进行光镜观察。如应用银加强的免疫金银法则更便于光镜观察。 4、免疫铁蛋白法 5、放射免疫自显影法 标本 1、组织标本：石蜡切片（病理切片和组织芯片）、冰冻切片 2、细胞标本：组织印片、细胞爬片、细胞涂片《分子实验》06 免疫组化实验免疫组化操作步骤 （一）、仪器设备 1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉. 2. 水浴锅 （二）、试剂 1. PBS缓冲液（ph7.2―7.4）：NaC137mmol/L，KCl 2.7mmol/L ,Na2HPO4 4.3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L. 2．0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,ph6.0,1000ml）：柠檬酸三钠3g,柠檬酸0.4g。3．0.5mol/L EDTA缓冲液（ph8.0）：700ml水中溶解186.1g EDTA& 8226;2H2O,用 10mmol/L NaOH调至ph8.0,加水至1000ml. 4. 1mol/L的TBS缓冲液（ph8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至ph8.0, 加水1000ml。 5. 酶消化液：a. 0.1%胰蛋白酶：用0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。b.0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。 6. 3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制 7.风裱剂：a. 甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（ph9.0–9.5）等量混合b 油和TBS(PBS)配制 8．TBS/PBS PH9.0–9.5,适用于荧光纤维镜标本;ph7.0-7.4适合光学纤维标本 （三）、操作流程 1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。 a 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟b 无水乙醇中浸泡五分钟 c 95%乙醇中浸泡五分钟 d 75%乙醇中浸泡五分钟 2、抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片： A 抗原热修复 a 高压热修复在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m枸橼酸钠缓冲溶液（ph6.0）.盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。将玻片置于金属染色加上，缓慢加压，是玻片在缓冲液中浸泡五分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后除去热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。此方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。 b 沸热修复电炉或水浴锅加热0.01枸橼酸钠缓冲液（ph6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10-15分钟。 c 微波炉加热在微波炉里加热0.01枸橼酸钠缓冲液（ph6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5-10分钟，反复1-2次。适用的抗原Bcl-2. Bax. AR. PR. C-fos. x-jum. z-kit. c-myc. E-cadherin. ChromograninA. Cyclin. ER. Heatshock. Protein. HPV.Ki-67.MDMZ.P53.P34.P15.P-glycoprotein.PKC.PCNA.ras.Rb.等 B 酶消化方法常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热37℃，消化时间约为5-30分钟。适用于被固定遮蔽的抗原：包括Collagen.GFAP. Complement.Cytokeratin.C-erB-2.LCA.LN.等 3、免疫组化染色SP法 （1）脱蜡、水化 （2）PBS洗2-3次各5分钟 （3）3%H2O2(80%甲醇)滴加在TMA上，室温静置10分钟免疫组化技术(原理、分类、步骤及主要试剂、设备准备)免疫组化技术 免疫组化技术业精于勤而荒于嬉 行成于思而毁于随免疫组化技术原理抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色 来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。 众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取 出来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并 用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原 - 一抗 - 二抗复合物，将抗原放大，由于抗 体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂 DAB 显示 为棕黄色颗粒） 。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产 物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨 基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。分类（常用）1、免疫荧光方法最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内 的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某 种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较 广。2、免疫酶标方法免疫酶标方法是继免疫荧光后， 60 年代发展起来的技术。 于 基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用， 然后加入酶的底物， 生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标 技术是目前定位准确、对比度好、染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。免疫酶标方法的发展非常迅速，已经衍生出了多种 标记方法，目前在病理诊断中广为使用的当属 PAP 法（过氧化物酶-抗过氧化物酶） 、ABC 法（卵白素-生物素-过氧化物酶复合物） SP 、SP 、即用型二步法（聚合物链接）等。 法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶） 链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶）3、免疫胶体金技术免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。胶体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白 的生物学活性则没有明显的影响。因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌 A 蛋白)等作为 探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以免 疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。由于胶体金本身呈淡至深红色，因此也适合进行光镜观察。如应用银 加强的免疫金银法则更便于光镜观察。4、免疫铁蛋白法 5、放射免疫自显影法标本1、组织标本：石蜡切片 石蜡切片（病理切片和组织芯片） 、冰冻切片 石蜡切片 2、细胞标本：组织印片、细胞爬片、细胞涂片---------------------------------------------------------------------------------华中科技大学同济医学院1免疫组化实验免疫组化实验 实验原理：应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使酶标记的抗体与显色剂进行显色反应，生成有色的不溶性产物，来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及相对定量。 实验目的：通过染色结果强弱，对所研究蛋白在组织水平的表达进行判断比较。（干净的背景会使结果判断的更加准确）。 在实验室实验时遇到的难题：染色强度不够，背景较深，染色对比不够明显。 实验效果不好的可能原因：一抗效果不够好，脱蜡水化后有机溶剂冲洗的不够干净，抗原修复的程度不够，二抗效果不够好，DAB染色时间过久。 修改后的protocol： 1.烘片：IHC白片，60度或70度烘箱，烘片40min。 2.脱蜡：二甲苯分别浸泡两次，10min/次。（脱蜡时间可以适当延长，不需严格遵守10min 时间，脱蜡脱得越干净越好） 3.水化：依次放入100%酒精，95%酒精，80%酒精，各2min。 4.自来水冲洗：水化后在自来水流水下冲洗。（水流不能太急，务必将有机溶剂完全冲洗 干净，否则会影响后续实验效果） 5.抗原修复：将片子浸没在抗原修复液中，高压锅20min，高温修复。 **实验室中可用小电饭锅或者微波炉替代，若在微波炉中操作，要保证液体在咕噜噜冒泡煮沸状态下煮20min，不然可能抗原修复力度不够。 **关于抗原修复液的选择：选用酸性柠檬酸缓冲液或碱性EDTA，最好根据抗体购买时说明书上推荐使用的缓冲液。 6.冷却：浸泡在修复液中冷却，时间充裕可放在室温下慢慢冷却；也可直接在室温冷却 10min后，用自来水流水冲洗冷却，但不可直接在自来水下冲洗冷却。 7.封闭：3% H2O2中浸泡10min，去除内源性的过氧化氢酶。 8.冲洗：清水冲洗，PBST清洗两次，摇床上3min/次。（摇床可以清洗的更干净） 9.封闭：封闭液（3% FBS或3% BSA或10%山羊血清）室温下封闭1h。 10.冲洗：PBST清洗三次，摇床上3min/次。 11.抗体孵育：一抗，按照稀释比稀释，37度烘箱湿盒中孵育1h（最好不要超过1h，不 然背景会很强），PBST摇床清洗3次，3min/次。二抗，按照稀释比稀释，37度烘箱湿盒中孵育30min。PBST摇床清洗3次，3min/次。 （如果可以，买抗体稀释液，成分更稳定） 12.显色：1XDAB显色，仔细观察，棕色显现后立马用自来水终止反应。（若第一次显色强 度不够，可以再次显色） 13.苏木精复染：苏木精染色1min，自来水冲洗，显微镜下观察，若不够可重复苏木精染 色。（苏木精没染好可以将苏木精洗去，再染，清洗配方没记得，后续再补充） 14.脱水：依次放入80%酒精，95%酒精，100%酒精，各2min。 15.封片：60度烘箱中烘干片子，中性树脂封片，完全晾干后，显微镜下观察，拍照。 注意点： ?本实验室所用切片一般是石蜡切片。免疫组化染色机种类介绍自动化免疫组化染色机种类介绍 免疫组化的传统技术正在受到新的快速高敏的新技术的挑战，一方面是新试剂的推出，如SP、EPOS、Envision和CSA，另一方面是自动免疫组化染色机的问世。免疫组化技术正进入一个新的发展阶段。从先进国家免疫组化规范化或标准化的进程来看，自动免疫组化染色机的应用几乎贯穿始终，早在20世纪末已得到极大的普及，然而国内的自动免疫组化染色机应用则在近几年才得以发展。浙江省肿瘤医院作为省内较早应用的少数单位之一，在自动化免疫组化染色的使用和质量控制方面获得些许经验，在此做简单的介绍交流。 自动化免疫组化染色技术是由电脑控制整个染色程序的免疫组化染色机，具有自动加抗体、自动冲洗、显色、复染及预处理等功能，有全自动和半自动、封闭型和半开放型之分。根据不同仪器大小，每次染色20～240张切片不等，整个染色程序约需60～90min左右，它不仅可以应用于免疫组化染色，某些仪器还可应用于组织化学染色、特殊染色及原位分子杂交染色。目前较为理想的仪器为Roche公司、Lecia公司及Thermo公司的产品等。下面对不同机型的自动免疫组化染色机的特点分述如下。 Thermo公司的LabVision Autostainer 该机型属开放式半自动系统类型，用户可任意编辑所需试剂及模板，内建试剂兼容性检测。切片特殊染色模板可任意调整试剂量、孵育时间。体系开放保证可适就性强，即可同时运行不同检测试剂盒和不同的染色程序及不同厂商生的的一抗。使用单一探头，探头材料为特氟伦包被不锈钢，检测探头交叉污染残留物 99%(总体积)。联合使用配套的抗原修复仪，可实现脱蜡与抗原修复一步完成。DAKO公司的 Autostainer系LabVision Autostainer贴牌产品，配合使用DAKO的Flex检测系统可获得极为敏感的免疫组化结果。早期的Biogenex i6000TM全自动染色仪亦属该类型产品，不同的是其加样头采用标准的Tip头加样，完全避免交叉污染的风险。 Lecia公司的Bond-Max}

直接上专利图:如上图，这些专利持有人为深圳摩尔雾化健康医疗科技有限公司，由深圳麦克韦尔100%控股。显然，通过专利图一眼就看得出来，这是一款便携网式超声波雾化器。其结构和外观与国内上市公司鱼跃医疗或九安医疗的产品如出一辙，售价在100元到200元之间，属耐用品，没有耗材，是完全没有看头的一个产品。管理层从没披露过公司在做便携网式雾化器，那么这东西会不会是布局海外的针对哮喘和慢阻肺的药械结合产品？虽然网式雾化器确实可以用来治疗哮喘和慢阻肺，但这是一种单纯的医疗器械，使用者自行购买药液打开顶盖加入设备，因此并非药械结合的产品。但一个细节吸引了我，第一张图中的雾化器顶盖部分与其他图中雾化器的顶盖部分并不是完全一样的，这是否代表这个雾化器并非只有一种形态？果然我又发现了一张图:在这张图中，雾化器顶部没有盖子，是开放式的，并且中间还有一根竖起的管子，很可能是需要把一颗封闭式药液弹从上方插入进来使用的。如果是这样的话，那应该也能找到药液弹的专利图。果然又从其他专利中找到了两张图:这两张图指出，这个雾化器分为a和b两种形态，可以通过拆卸雾化核心模块（本帖第二张图）来更改使用模式。b模式是传统的自行加药，a模式为插入成品药弹使用。显然a模式因为无法自行添加药液，必须购买专为本雾化器设计的成品药弹，因此是符合药械结合的产品。海外的Pneuma Respiratory也是这种形态的药械结合产品，用于治疗哮喘、慢阻肺和非小细胞肺癌。
因此海外管线的产品很有可能就是这东西，因为药械结合的产品需要医药企业和医疗器械企业共同合作开发，通常都有很高的技术壁垒，开发周期很长，不是随随便便就能搞的东西。最后再发点其他有趣的专利发现。比如先前已经披露过的完全按照爱尔真开发的应用于icu的雾化给药产品专利:下面是和康希诺合作的爱尔真雾化给药装置实物图:长得是几乎一模一样。有趣的来了，翻阅这个东西的专利资料会发现，这玩意的功能专利是归属思摩尔，但外观专利却共同属于思摩尔和广州国家实验室:而根据专利中广州国家实验室的地址:广州国际生物岛星岛环南路9号可以确定，这是由钟院士领衔的针对全球公共卫生的大型综合研究基地和创新策源地。因此几乎可以确定，针对这个产品王贵升提到的是为解决卡脖子技术的国家任务，就是国家为定点医院 ICU 床位要达到床位总数10%的提前布局。最后再发几个有意思的玩意儿:这个东西能看出来是啥吗？其实这是蒸醒目润眼仪的液体仓剖面图。那下头这个是啥呢？这玩意看起来非常像蒸醒目，但经过仔细对比发现好像不是，可能是即将要上市的雾化美容产品？还有这个东西:因为小时候拆过望远镜，一眼就能看出来这是一个通过旋转控制伸缩的东西，不知道是应用在哪里的呢？因最近发布的思摩尔深挖系列文章经常被举报限流或是踢出个股讨论区，如找不到某一篇，请在我的专栏中查看，我没有删除。$思摩尔国际(06969)$ }