构建稳定高效表达c-met蛋白的大鼠骨髓间充质干细胞细胞

[0001] 本涉及细胞技术领域，特不是一种构建稳定高效表达-met蛋白的大鼠骨髓间充质干细胞细胞株的方法。

[0002] c-met基因是由α链和β链组成的异源二聚体，其编码是跨膜酪酸激酶受体(RTKS)超家族成员之一，具有自主磷的活性。生长因子(HGF)为c-met的配体，其与受体c-met特异结合后，可诱导c-met构象发生改变，进而激活细胞内蛋白激酶结构域中的PTK发生化，进一步激活下游转导通路而发挥效应。

肝衰竭是目前严重威胁人类健康的之一，该病病情凶险，进展迅速，病死率高。目前，肝移植是该病最有效的方法，但因各方面条件的缺乏而受到限制。因此，寻找一种新的方式治疗肝衰竭至关重要。骨髓间充质干细胞(BMSCs)是一种能自我复制和具有多向分化潜能的非造血干细胞，且易于分离，增殖能强，在适宜的信号刺激下可以向不同组织类型细胞分化，易于进行外源性基因的和其蛋白的表达。Yijing Cai等研究发现，移植骨髓间充质干细胞可显著改善肝衰竭患者肝功能，但经移植BMSCs治疗的肝衰竭患者肝功能只在短期内均可以获得明显改善，但其远期生存率并无明显改善。

造成上述原因可能是BMSCs回输后归巢于肝脏细胞数过少，以及其归巢的细胞分化再生能力差。研究发现，HGF/c-met受体通路与骨髓间充质干细胞归巢密切相关，且影响BMSCs向类肝细胞分化及调节肝细胞的再生功能；也有研究表明肝衰竭患者肝细胞再生障碍与肝细胞c-met基因表达平下降，HGF/c-met通路受损有关。因此，建立稳定高效表达c-met的BMSCs细胞株，对于以后研究BMSCs治疗肝衰竭时,c-met对BMSCs归巢于肝脏及向肝细胞分化的影响，以及相应机制及是否以后可作为治疗肝衰竭患者的一种新的、更有效的都是十分重要的。且相比以往常见的瞬时转染技术，稳定转染解决了其转染效率低，转染的外源基因不能整合到细胞基因组，转染的基因表达时间短等缺点。目前尚未见到关于构建稳定表达c-met的BMSCs细胞株的研究和报道。

[0005] 针对上述问题，本发明提供一种可以稳定表达c-met的BMSCs细胞株的构建方法，用于多种的相关机制研究，本发明是这样获得的：

[0011] C)利用限制性内切酶AgeI酶切慢病毒载体GV35，配置酶切体系，用移液器轻轻吹打混匀，于37℃反应3h，即获得慢病毒载体GV358的酶切产物线性化载体DNA；

[0013] D)于水浴中配制线性化载体DNA和目的基因重组反应体系，配制时用移液器轻轻吹打混匀，避克产生气泡；配制后将反应体系置于37℃反应30min，获得慢病毒表达载体GV358-c-met；

[0016] 培养6h后，弃去含有转染混合物的培养基，缓慢加入含10％血清的细胞培养基10ml，于37℃、含5％CO2的细胞培养基中继续培养48-72h；

F)收集转染后48h(转染时即为0h计起)的293T细胞上清液，于4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片；取上清液以0.45μm滤器过滤并于40ml的超速离心管中，将带有病毒上清液的超速离心管逐一放入至Beckman超速离心机内,设置离心参数为25000rpm，于4℃离心2h；离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液(购自上海吉凯基因化学技术有限公司),获得c-met基因慢病毒；

转染前一天，将处于对数生长期的BMSCs接种于96孔板中，每孔加入4～5×104个细胞(接种密度为细胞3～4天长满为宜)及100μl含10％血清的细胞培养基，放入细胞培养箱中培养；当细胞融合度达到25％-35％时，弃去原培养基，以感染复数(MOI＝100)进行转染，即向各孔中加入10μl步骤F)获得的c-met基因慢病毒(病毒滴度为2×108TU/ml)、10μl终浓度为5μg/ml的ploybrene增强液和80μl的含10％血清的细胞培养基，于37℃、含5％CO2培养箱中培养；感染12h后，弃去培养基，每孔加入100μl含10％血清的细胞培养基；在转染48h后，即可用观察转染情况；感染72h后，再次以含10％血清的细胞培养基换液，并向每孔加入终浓度为9μg/ml的嘌呤毒素，药物筛选周期为一周，并在荧光显微镜下观察效果，待显微镜下观察细胞荧光阳性率达100％后，将药物筛选浓度维持在1.8μg/ml，即获得稳定高效表达c-met蛋白的大鼠骨髓间充质干细胞细胞株；

[0020] 其中，所述含10％血清的细胞培养基配制方法为：该培养基中含89％的DMEM培养基(购自Hyclone公司)、10％的胎血清(购自Corning公司)和1％的青霉素-溶液(购自碧天公司)。

优选的，在本发明所述构建稳定高效表达c-met蛋白的大鼠骨髓间充质干细胞细胞株的方法中，步骤E)所述细胞密度为70％～80％的293T细胞是这样获得的：转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，以含10％血清的细胞培养基调整细胞密度约为5×106细胞/15ml，接种于直径为10cm的细胞培养皿中，于37℃、含5％CO2的培养箱内培养，待细胞密度达70％～80％时即可用于转染；并于转染前2h更换培养基为无血清培养基。

[0022] 本发明所使用的细胞为大鼠骨髓间充质干细胞，来自于4周龄SPF级SD雄性大鼠胫骨和肱骨提取获得。

[0023] 本发明提供一种稳定表达c-met的BMSCs细胞株，以突破现有的关于骨髓间充质干细胞治疗肝衰竭的研究方向。通过BMSCs稳定高效表达c-met，以实现BMSCs治疗肝衰竭时更好的归巢于肝脏及向肝细胞分化，以及研究其相应作用机制，对于肝衰竭治疗的研究和发展具有重要意义。该细胞株还可用于多种肿瘤的相关机制研究。说明

[0024] 图1是大鼠骨髓间充质干细胞镜检查(×100)照片；

[0025] 其中，A:原代细胞；B:第五代细胞。

[0033] 图6是不同浓度嘌呤霉素筛选4天后大鼠骨髓间充质干细胞结果镜检(×100)示意图；

[0036] 图中，A:白光视野；B:荧光视野。

[0037] 图8是慢病毒转染BMSCs筛药一周后荧光显微镜(×100)下观察GFP荧光图；

[0038] 图中，A:白光视野；B:荧光视野。

[0041] 图10是稳定表达c-met的BMSCs组、稳定表达GFP的BMSCs组和生理盐水组分别治疗肝衰竭SD大鼠72h后三组肝脏病理图(A:稳定表达c-met的BMSCs治疗组肝脏病理图(×100),B:稳定表达GFP的BMSCs治疗组肝脏病理图(×100)，C:生理盐水治疗组肝脏病理图(×100))。

[0042] 图11是稳定表达c-met的BMSCs组、稳定表达GFP的BMSCs组和生理盐水组三组SD大鼠生存率图。

[0043] 下面结合附图，对本发明进行具体描述。

[0044] 涉及实验材料与仪器:

[0045] 4周龄SPF级SD雄性大鼠购于南京医科大学医药实验动物中心；

[0048] 大鼠淋巴细胞分离液购于天津市灏洋生物制品科技有限责任公司；

[0055] 纯化的质粒DNA购自上海吉凯基因化学技术有限公司；

[0056] 限制性内切酶购自NEB公司；

[0059] 琼脂糖凝胶DNA回收购自天根生化公司；

[0061] 病毒保存液购于吉凯公司；

[0062] 细菌摇床购自华利达实验设备公司；

[0066] 凝胶成像仪购自天能公司。

[0067] 实施例涉及的培养基：

[0069] 含有氨苄青霉素抗生素的LB平板：向LB液体培养基中加入琼脂粉15g/100ml,高压使其完全溶解，然后待该液体冷却到60度左右时，加入终浓度100ng/ml的氨苄青霉素，再将该液体倒入细菌培养板中，冷却形成平板；

[0070] 含10％血清的细胞培养基配方：以百分百计，将89％的DMEM培养基(购自Hyclone公司)、10％的胎牛血清及(购自Corning公司)1％的青霉素-链霉素溶液(购自碧云天公司，100×双抗)混合后获得。

[0079] (1)大鼠骨髓间充质干细胞的提取与培养

选取4周龄SPF级SD雄性大鼠，颈椎脱臼法处死，取出胫骨和股骨，去除两端干骺端，用5毫升吸取生理盐水冲洗骨髓腔于50毫升离心管中，1000rpm离心冲洗液10min后，采用3ml含10％血清低糖培养基冲悬离心管底部沉淀，将液体加入到含3ml大鼠淋巴细胞分离液的15毫升离心管中，2000rpm离心20min后，吸取离心管中第三层白膜层，并加入到含有其4倍体积生理盐水的离心管中，1000rpm离心10min，含10％血清低糖培养基冲悬底部沉淀接种到培养皿中，并将细胞放入37℃、含5％CO2培养箱内培养，培养到第5代用于实验；

[0081] 图1为大鼠骨髓间充质干细胞显微镜(×100)放大照片，其中图1A为原代细胞，图1B为第五代细胞；提取的细胞1天后即可贴壁，第3天开始出现形变，第7天形成MSC簇，并逐渐向周边增殖扩大，生长成形的BMSCs形态均一，呈梭形、纺锤形，细胞排列紧密,呈状或扫帚状排列。

[0082] (2)大鼠c-met基因过表达慢病毒载体构建与鉴定

[0090] 从而获取目的基因(c-met基因)；该目的基因片段2.5％琼脂糖凝胶电泳图如图2所示(M泳道为分子量标记)，由图2可见，产物经琼脂糖凝胶电泳显示扩增片段为4190bp，与目的基因大小相符。

[0091] b)根据表3，配制50μl酶切体系，按表3顺序依次加入各种试剂，用移液器轻轻吹打混匀，置于37℃反应3h，以获得慢病毒载体GV358的酶切产物，以获得线性化载体DNA。

[0094] 图3为该GV358载体图谱，该载体元件顺

[0096] c)再以线性化载体DNA和目的基因扩增产物于冰水浴中配制如下反应体系(表4)。用移液器轻轻吹打混匀，避克产生气泡,于37℃反应30min。以获得由线性化载体和目的基因重组形成的慢病毒表达载体GV358-c-met；

[0099] d)将10μL慢病毒表达载体GV358-c-met加入到100μL感受态细胞DH5α中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min后，42℃水浴锅中热激90s，接着在冰水浴孵育2min；然后加入到500μL LB液体培养基中,置于37℃摇床振荡培养1h；

[0100] 取100μL菌液均匀涂布在含有氨苄青霉素抗生素的LB平板上在恒温培养箱中倒置培养12-16h；再挑取平板上的单克隆进行PCR鉴定，具体方法为配制如下反应体系，震荡混匀。在超净中，用无菌的枪头挑取平板上单个菌落至20μL鉴定体系中，吹打混匀，置于PCR仪中进行反应。

[0105] 将PCR产物行琼脂糖凝胶电泳，结果示PCR产物大小为1181bp，表明该单克隆菌落为阳性。再对该阳性克隆进行测序及结果分析。接着将该正确的克隆菌液扩大培养、抽提，以获得高纯度质粒(大小为1181bp)。

图4为重组载体GV358-c-met阳性克隆PCR鉴定结果电泳图，图4中，1：阴性对照(ddH2O),2：阴性对照(GV358空载自连对照组),3：阳性对照(GAPDH，该基因购自上海吉凯基因化学技术有限公司),4：Marker,5-12：c-met 1-8号转化子；可见1-8号转化子转化后行阳性克隆PCR鉴定(PCR产物大小为1181bp)，结果一致，表明慢病毒重组载体构建成功。

[0108] 1)转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞以含10％血清的培养基调整细胞密度约5x106细胞/15ml，重新接种于10cm细胞培养皿，37℃、5％CO2培养箱内培养。24h后待细胞密度达70％～80％时即可用于转染；并于转染前2h更换为无血清培养基(购于Hyclone公司)；

[0110] 3)培养6h后弃去含有转染混和物的培养基，并缓慢加入含10％血清的细胞培养基10ml，于37℃、含5％CO2培养箱内继续培养48-72h；

[0111] 4)收集转染后48h(转染时即为0h计起)的293T细胞上清液；于4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片；再以0.45μm滤器过滤上清液于40ml的超速离心管中；然后分别配平样品，将带有病毒上清液的超速离心管逐一放入至Beckman超速离心机内,设置离心参数为
25000rpm，离心时间为2h，离心控制在4℃；离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液(购自上海吉凯基因化学技术有限公司),获得c-met基因慢病毒；

采用荧光法测定病毒滴度，测定前一天，使用293T贴壁细胞铺板，96孔板，每孔4×104个细胞；准备7个无菌的EP管，每管中加入90μl无血清培养基(购于Hyclone公司)，取待测定的病毒原液10μl加入到第一个管中，混匀后，取10μl加入到第二个管中，继续相同的操作直到最后一管；选取所需的细胞孔，弃去90μl培养基，加入90μl稀释好的病毒溶液，培养箱培养，4天后，观察荧光表达情况，荧光细胞数随稀释倍数的增加而减少，根据公式：病毒滴度＝荧光细胞数/病毒原液量，即可算出病毒滴度。图5为转染293T细胞72h后荧光显微镜(×100)下观察GFP荧光图，图5A为白光视野，图5B为荧光视野；可见，c-met慢病毒转染293T细胞，转染后72h，荧光显微镜下观察荧光阳性率可达90％以上，按上述方法根据公式计算病毒滴度为2×108TU/ml。

取对数生长期的大鼠骨髓间充质干细胞,用2mlPBS(购于Hyclone公司)清洗两遍后，加入2ml胰酶(购于Sigma公司)消化2min，显微镜下观察BMSCs已全部消化下来后，加入2ml含10％血清低糖培养基终止消化，并将其加入到15ml无菌离心管中，1000rpm离心5min，弃去上清，加入6ml含10％血清低糖培养基冲悬底部沉淀，并将其接种于6孔板中。待各孔细胞长满后，弃去原培养基，梯度加入含嘌呤霉素的含10％血清低糖培养基2ml，各孔嘌呤霉素浓度分别为0、6、7、8、9、10μg/ml。37度、5％CO2细胞培养箱培养。细胞每两天更换一次含相应浓度嘌呤霉素的完全培养基，并每天对各孔细胞生长情况进行观察。4天可以杀死相应孔中全部细胞的嘌呤霉素最低浓度即为最终药物筛选浓度。

[0116] 图6是不同浓度嘌呤霉素筛选4天后大鼠骨髓间充质干细胞显微镜照片(×100)，其中A:0μg/ml、B:6μg/ml、C:7μg/ml、D:8μg/ml、E:9μg/ml、F:10μg/ml；可见，药物浓度为9μg/ml时，即可杀死全部细胞，故最终确定嘌呤霉素筛选浓度为9μg/ml。

[0117] (6)重组慢病毒载体转染大鼠BMSCs及转染后嘌呤霉素筛选

转染前一天，将对数生长期的大鼠骨髓间充质干细胞接种于96孔板中，每孔加入4～5×104个细胞(接种密度为细胞3～4天长满为宜)；并向每孔中加入100μl的含10％血清的低糖培养基，然后放入37度、5％CO2细胞培养箱培养。当细胞融合度达到30％左右时，弃去原培养液，按照步骤(5)实验的结果，以感染复数(MOI＝100)进行转染，向各孔中加入10μl病毒液(病毒液为步骤3获得的病毒原液，其病毒滴度为2×108TU/ml)、10μl终浓度为5μg/ml的ploybrene增强液和80μl的含10％血清的低糖培养基，并将细胞放回37度、5％CO2细胞培养箱孵育。待感染后12h弃去原培养液，换回含10％血清的低糖培养基。在转染48h后，即可用荧光显微镜观察转染情况，图7即为慢病毒转染BMSCs 48h后荧光显微镜(×100)下观察GFP荧光图，图7A:白光视野；图7B:荧光视野；可见，c-met慢病毒转染BMSCs 48h后，荧光显微镜下观察可见荧光，GFP阳性细胞占总细胞10％；

[0119] 转染72h后，细胞换液(换含10％血清的低糖培养基)并向各细胞培养基中加入嘌呤霉素(浓度为9μg/ml),药物筛选周期为一周，一周后在荧光显微镜下观察效果，可见细胞荧光阳性率达100％。接着把嘌呤霉素药物浓度维持在1.8μg/ml，十天后在荧光显微镜下继续观察效果，可见细胞荧光阳性率仍然维持在100％。故获得稳定表达c-met基因的细胞株。

[0120] 图8是慢病毒转染BMSCs筛药一周后荧光显微镜(×100)下观察GFP荧光图，其中，图8A:白光视野，图8B:荧光视野，可见，筛选一周后荧光阳性率达100％，即形成稳定表达c-met基因的大鼠BMSCs。

[0124] 弃去细胞培养液，PBS洗涤两次后吸净，再加入150ul 1×Lysis buffer(购于碧云天公司)，用移液枪头吹打至细胞充分裂解,得到的细胞裂解样品转移入EP管中，冰上再裂解细胞10-15min,接着4℃，12000g，离心5min，放入沸水中水浴10min后,接着4℃，12000g，离心1min，-80℃保存备用。

等胶好后，拔去梳子，电泳缓冲液清洗上样孔，将准备好的样品进行上样，上样完毕后接通电源，核对正负极后开始电泳，电泳时恒压80V，2小时。电泳结束后，使用转移电泳装置，在4℃，300mA恒流条件下电转150min，将蛋白转移到PVDF膜上(购于millipore公司)。用封闭液(含5％牛奶的TBST溶液)室温封闭PVDF膜1h，一抗(兔抗c-met,5ml)孵育2h后，TBST洗膜3次，二抗(驴抗兔IgG,15ml)孵育2h，TBST洗膜3次。采用Amersham公司ECL+plusTM Western blotting system试剂盒进行显色，曝光，成像分析。

[0130] (8)稳定表达c-met的BMSCs组、稳定表达GFP的BMSCs组和生理盐水组分别治疗肝衰竭SD大鼠72h后三组大鼠肝脏病理改变情况

选取6周龄SD雄性大鼠(体重220-260g)15只，分为三组(A、B、C)，每组5只。采用D-氨基半乳糖(剂量900mg/kg，购自Sigma公司)和LPS(剂量10ug/kg，购自Sigma公司)联合注射制造大鼠肝衰竭模型。待造模完成24h后，A组SD大鼠通过尾静脉注射稳定表达c-met的BMSCs(剂量为1.4×107个细胞/kg,溶于1ml生理盐水中),B组SD大鼠通过尾静脉注射稳定表达GFP的BMSCs(剂量为1.4×107个细胞/kg,溶于1ml生理盐水中)，C组SD大鼠通过尾静脉注射1ml生理盐水。待注射完成72h后，颈椎脱臼法处死三组SD大鼠，分别取出肝脏放于4％甲(购自西陇化工股份有限公司)中浸泡固定，HE观察三组SD大鼠肝脏病理改变。

图10是稳定表达c-met的BMSCs组、稳定表达GFP的BMSCs组和生理盐水组分别治疗肝衰竭SD大鼠72h后三组肝脏病理图(A:稳定表达c-met的BMSCs治疗组肝脏病理图(×100),B:稳定表达GFP的BMSCs治疗组肝脏病理图(×100)，C:生理盐水治疗组肝脏病理图(×100)。从三组病理图可见，稳定表达c-met的BMSCs治疗组肝脏病理未见明显肝细胞变性及大片肝细胞和炎性浸润，稳定表达GFP的BMSCs治疗组肝脏病理可见肝细胞变性、水肿和炎性浸润，未见大片肝细胞坏死，而生理盐水治疗组肝脏病理可见明显肝细胞变性、水肿及大片肝细胞坏死和炎性浸润。表明A组SD大鼠治疗效果最好。

[0133] 实施例2 稳定表达c-met的BMSCs组、稳定表达GFP的BMSCs组和生理盐水组分别治疗肝衰竭SD大鼠后大鼠生存率

(剂量为1.4×10个细胞/kg,溶于1ml生理盐水中)，C组SD大鼠通过尾静脉注射1ml生理盐水。然后观察三组SD大鼠的生存情况。

[0136] 图11是稳定表达c-met的BMSCs组、稳定表达GFP的BMSCs组和生理盐水组三组SD大鼠生存率曲线图，由图可见，1周后，A组(c-met-BMSCs组)SD大鼠死亡1只，B组(GFP-BMSCs组)SD大鼠死亡3只，C组(生理盐水组)SD大鼠全部死亡。表明A组SD大鼠治疗效果最好。

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