Western blot(蛋白印迹)作为科研研究中最为平常的实验，却蕴含了很多知识，可谓是小实验里却有大文章。尽管绝大多数研究僧在接触该实验时都会被虐的体无完肤，却也在和WB斗志斗勇的过程中积累了不少经验。正所谓前人种树，后人乘凉，现在中洪君就把前辈做WB实验的经验总结起来，希望对大家能有所帮助。

1. 裂解buffer：每种裂解buffer都有其擅长的用途，市面上常见的裂解buffer见下表：

干扰蛋白：培养细胞、动物组织都存在血清成分，血清中存在大量的白蛋白与免疫球蛋白，这些蛋白会经常性的出现杂带干扰，一般白蛋白杂带在70kDa处，免疫球蛋白杂带出现在50kDa处；有人怀疑：“我的抗体也不识别这些蛋白啊！”，现实不是这样的，当某种蛋白含量超过一定量的时候，即使很少的非特异吸附都有可能造成信号的富集而造成杂带；建议广大战友在提取细胞蛋白的时候，一定要使用PBS漂洗细胞至少3次，去除残留的培养基成分；提取组织的时候，尽量去除组织中血液的残留，这样样本中的干扰因素才会减少到最低。

正确选择凝胶浓度与电泳条件能够让目的蛋白区域最大限度的分离开，从而使条带的位置，杂带位置等一些因素的影响降到最低；胶浓度及电泳条件的选择见下表：

对于分子量10-15kDa的指标转膜时间不宜过长，100V、冰浴45min足矣；对于分子量指标150kDa以上的指标，100V、冰浴2h也足够了；其他介于15-150kDa之间的指标100V、冰浴1h完全可以保证效果。

准备PVDF膜的大小要与切割后的凝胶大小一致或略小，滤纸和海绵大小也要一致；制作“三明治”不能太厚也不能太薄，太厚容易使胶变形，条带弯曲，太薄气泡容易进入，导致条带不完整，这些都可以用增加减少滤纸量来改善；一定要把目的蛋白分子量区域贴在膜的中间部位；分清楚正极与负极，避免反方向转印；转印缓冲液要提前预冷，整个转印过程也需要在冰浴中进行。

可能导致预测与实际分子量不一样的因素：

由于预染marker是由标准蛋白与有色染料偶联而成的，所以偶联后的蛋白由于表面结构的改变，导致在SDS-PAGE中分离的线性关系没有天然蛋白那么好；另外由于偶联的批次不同，每个条带针对每个批次呈现出的分子量会有些许的变化，所以在使用预染marker的时候，出现5-10%的分子量误差是不能避免的，如果需要确切分子量需要用非预染marker来标定。

很多蛋白在人源、大鼠源、小鼠源中存在的长度并非完全一致，具体问题还要具体分析；

这个数据库提供了关于蛋白预测分子量，亚型分类，转录本种类及最初发现这个蛋白的一些参考文献，Abcam、Santa cruz等著名抗体公司都有参考这个数据库进行抗体的设计。

Western结果往往就处于“白板”与“黑板”之间的某个条件：

1. 白板：“白板”代表的意义是某些条件不足：

2. 黑板：“黑板”顾名思义相对于“白板”，“黑板”代表的意义就是某些条件过量了；

封闭也是Western中比较关键的环节，一般常规的条件是5%脱脂奶粉溶于1×TBST中，常温下摇床缓慢摇晃，封闭1h；除此之外还需要向大家介绍另外一种封闭液—0.5% 明胶，这两种封闭液都适用于常规的Western实验，他们之间的取舍关系可近似认为，如果用脱脂奶粉封闭结果是“白板”或者信号较弱，可以考虑换明胶；如果用明胶封闭，结果杂带较多，背景较深可以考虑用脱脂奶粉；甚至有的时候两者可以混合起来使用，具体的细节需要大家在实验中细细品味。

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