铜绿假单胞菌( Pseudomonas aeruginosa) 又称绿 脓杆菌，属于 γ－变形菌纲假单胞菌科，是一种在自然 界中广泛存在的条件性致病菌。铜绿假单胞菌 生存能力极强，能在各种环境中存活，并在机体免疫 功能低下或受损时引发感染，可引起人体烧伤或 创伤部位的伤口感染、中耳炎、角膜炎、肺炎甚至败血 症; 奶牛或奶羊乳房炎; 水貂出血性肺炎; 雏鸡败血症; 仔猪腹泻等疾病。近年来，铜绿假单胞菌抗 生素耐药问题日趋严重，因此疫苗研发再次成为国内 外学者研究的热点。2000 年，完成了铜绿假单 胞菌 PA01 菌株基因组测序，从而为认知该物种的复 杂性提供了帮助。

清洁级 ICＲ 品系小白鼠 105 只，雌性，体重为 18 ～ 22 g; 清 洁 级 豚 鼠 15 只，雌 性，体 重 为 250 ～ 350 g; 均购自黑龙江省中医药大学实验动物中心。

0. 9%氯化钠注射液，购自哈尔滨三联药业股份有限公司。

铜绿假单胞菌内毒素蛋白、类毒素( 由外毒素 A 脱毒制备) 、外膜蛋白样品及内毒素蛋白阳性血清、 类毒素阳性血清、外膜蛋白阳性血清和阴性血清，由 中国医学细菌保藏管理中心铜绿假单胞菌专业实验 室提供; PBST 缓冲液，购自上海莼试生物技术有限公 司; 牛血清白蛋白，购自盐城赛宝生物科技有限公司; 辣根过氧化物酶标记的SPA，购自上海科汇生物技术有限公司; 鲎试剂、细菌内毒素工作标准品、细菌内毒素检查用水，购自厦门市鲎试剂实验厂有限公司; 硫 柳汞钠，购自上海信裕生物科技有限公司。

生物安全柜( 型号为 CLASS Ⅱ TYPE A2) ，购自北京东联哈尔仪器制造有限公司; 电热恒温培养箱 ( 型号为 DNP－9082) ，购自上海精宏实验设备有限公 司; 独立送风隔离笼具( 型号为 IVC－II) ，购自苏州冯 氏实验动物设备有限公司; 多功能酶标仪( 型号为 Infinite M200 PＲO) ，购自瑞士 Tecan 公司。

2. 1 内毒素蛋白、类毒素和外膜蛋白抗体效价的检测

取铜绿假单胞菌内毒素蛋白、类毒素和外膜蛋 白，在百级洁净条件下以 0. 9%氯化钠注射液分别制 备成 0. 4 mg /mL 的溶液，加入终浓度为 0. 01%的硫 柳汞钠，混合均匀后用 0. 22 μm 滤器过滤，分装成针 剂，4. 3 mL /安瓿。 取 32 只小白鼠，将其分成 4 组，每组 8 只，其中 3 组分别用上述 3 种蛋白针剂腹部皮下免疫小鼠，首 免 0. 1 mL，二免 0. 2 mL，三免 0. 3 mL，每次间隔 3 d。 剩余 1 组为 0. 9%氯化钠注射液对照组，免疫时间及 剂量与另 3 组相同。 免疫前小鼠断尾采血，首免后每间隔 7 d 采血， 共采血 7 次，4 ℃、4 000 r /min 离心 10 min 收集血 清。间接 ELISA 法测定血清抗体水平，参照殷州 的方法。1) 包被抗原 100 μL /孔，4 ℃ OD450值，数据用“平均值±标准 差”表示。

2. 2 内毒素蛋白、类毒素和外膜蛋白内毒素含量的测定

按照《中华人民共和国药典》( 2015 年版) 中规 定的方法进行试验。

2. 2. 1 细菌内毒素限值的确定

细菌内毒素限值 ( L) = K/M，式中 K 为人每千克体重每小时最大可接受 的内毒素剂量，单位为 EU/( kg·h) ; M 为人每千克体重 每小时的最大供试品剂量，单位为 mg /( kg·h) 。《中华 人民共和国药典》( 2015 年版) 中规定，注射剂 K = 5 EU/( kg·h) ; 3 种蛋白每次最大注射剂量为 0. 12 mg， 人均 体 重 按 60 kg 计

采用间接 ELISA 法检测 3 种蛋白免疫组和对照 组小鼠血清抗体水平，结果 3 种蛋白免疫后小鼠血清 抗体效价均随免疫进程持续升高，免疫组与对照组差 异显著( P＜0. 05) ，见表 1。

铜绿假单胞菌内毒素蛋白免疫原性很好，但内毒 素含量略高，以其作为疫苗的主要成分会有一定的不 良反应; 外毒素 A 经甲醛脱毒而成的类毒素和外膜 蛋白的免疫原性也较好，且内毒素含量较低，因此本研究测定了内毒素蛋白、类毒素和外膜蛋白的免疫原 性和内毒素含量，制备了 5 组混合蛋白疫苗。研究表 明: 3 号混合蛋白疫苗的免疫效果与内毒素蛋白持 平，估计是 3 种抗原组分联合免疫后对机体的免疫系 统产生了协同效应，而且 3 号混合蛋白疫苗内毒素含量低于内毒素蛋白，有希望成为一种免疫效果好、不 良反应少的铜绿假单胞菌疫苗。

将外毒素（毒性物质）经过0.3%～0.4%甲醛处理，获得类毒素（无毒物质），然后，用类毒素免疫动物，在动物血清中获得抗毒素（可用于疾病治疗）．上述过程如下：
下列关于外毒素、类毒素和抗毒素的叙述，错误的是（　　）

动物免疫接种及疫苗基础知识

免疫接种是给动物接种疫苗或免疫血清，使动物机体自身产生或被动获得对某一病原微生物特异性抵抗力的一种手段。通过免疫接种，使动物产生或获得特异性抵抗力，预防疫病的发生，保护人、畜健康，促进畜牧业生产健康发展。

由病原微生物、寄生虫以及其组分或代谢产物所制成的、用于人工自动免疫的生物制品，称为疫苗。给动物接种疫苗，刺激机体免疫系统发生免疫应答，产生抵抗特定病原微生物（或寄生虫）感染的免疫力，从而预防疫病。

由细菌、病毒、立克次氏体、螺旋体、支原体等完整微生物制成的疫苗，称为常规疫苗。常规疫苗按其病原微生物性质分为活疫苗、灭活疫苗、类毒素。

利用分子生物学、生物工程学、免疫化学等技术研制的疫苗，称为新型疫苗，主要有亚单位疫苗、基因工程疫苗、合成肽疫苗、核酸疫苗等。

活疫苗是指用通过人工诱变获得的弱毒株，或者是自然减弱的天然弱毒株（但仍保持良好的免疫原性），或者是异源弱毒株所制成的疫苗。例如布鲁氏菌病活疫苗、猪瘟活疫苗、鸡马立克氏病活疫苗（Ⅱ型）、鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒活疫苗等。

（1）免疫效果好。接种活疫苗后，活疫苗在一定时间内，在动物机体内有一定的生长繁殖能力，机体犹如发生一次轻微的感染，所以活疫苗用量较少，而机体所获得的免疫力比较坚强而持久。

（2）接种途径多。可通过滴鼻、点眼、饮水、口服、气雾等途径，刺激机体产生细胞免疫、体液免疫和局部黏膜免疫。