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向样品中加入浓硫酸和催化剂，充分混匀，然后加热消化分解，样中碳和氢被氧化成二氧化碳和水，其中的有机氮转化为硫酸铵。碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质的含量。

由于食品种类繁多，形态及含氮量不一,因此取样应均匀，称样量应准确合理。对取样较困难的半固体(如冰淇淋)可置于已记重的纸片上称重(样品重=总重-纸片重) ,样品称好后,与纸片一起置于凯氏烧瓶底部。为减少系统误差可于空凯氏烧瓶中同时投入相同规格的纸片一张同时作空白。对于不同含氮量的食品，为保证终点滴定消耗酸的体积数在有效范围,取样量应视样品含氮量而定,-般含量在5 %~

浓硫酸具有脱水性和氧化性，可使有机物中的碳、氢被氧化为二氧化碳和水，蛋白质会分解为氨，然后氨与硫酸结合生成硫酸铵。通常加入硫酸钾和硫酸铜作为催化剂来加快蛋白质分解。硫酸钾可以提高溶液的沸点，一般情况下，纯硫酸的沸点在340 ℃左右，但是在添加硫酸钾后，可提高至400 ℃以上。提高温度使有机物加快分解。但是不能加入过多的硫酸钾，否则会因为温度过高，使生成的硫酸铵发生热分解成氨而造成损失。硫酸铜除作为催化剂外，还可以指示消化终点的到达，有机物全部消化完全后，溶液呈现清澈的蓝绿色，硫酸铜还可以做蒸馏时碱性反应的指示剂。

消化液中的硫酸铵在碱性环境下会转化成氨。为防止水中微量的氨气受热逸出，影响测定结果，所以水蒸气发生器中的水要保持酸性。硫酸铵是一种强酸弱碱盐，需要足够的碱液使结合态的氨完全反应并释放出来，这个过程中的氢氧化钠一定要过量，过量的氢氧化钠会与硫酸铜生成蓝色的氢氧化铜沉淀，氢氧化铜受热分解成黑色的氧化铜沉淀。检验蒸馏是否完成，可用奈氏试纸法，NH4 或NH3遇奈氏试剂会反应生成棕红色的碘化汞铵化合物。

加热蒸馏放出的氨可用硼酸溶液吸收，硼酸有吸收氨的作用，又因其呈微弱酸性，不影响下一步滴定时指示剂的变色反应。温度过高会使硼酸吸收液对氨的吸收作用减弱，从而造成损失，故一般不超过40 ℃。

待吸收完全后，用硫酸或者盐酸标准溶液进行酸碱滴定，滴定液的浓度直接影响结果的准确性，必须按照要求进行配制和标定。混合指示剂在中性溶液中呈灰色，滴定终点时液体呈灰色。

①所用的试剂溶液应用无氨蒸馏水配制；

②取样应具有代表性,取样前将样品充分混匀；

③样品称量放入凯氏烧瓶时，切勿使样品粘附在瓶颈部，避免样品未消化完全而造成氮损失；

④为了保证使烧瓶壁上的残渣消化完全，在消化过程中要不时地转动凯氏烧瓶；

⑤消化脂肪或糖含量较高的样品时，易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出，消化时应先消化加热并不断摇动，或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂；

⑥当样品消化液浑浊或未澄清透明时，可先将凯氏烧瓶放冷至室温后，再加入30%的过氧化氢，然后继续加热消化；

⑦加碱后，漏斗要进行水封，避免因装置漏气造成氨的逸出影响结果的准确性；

⑧要保证蒸馏装置不能漏气；

⑨在蒸馏时反应室与外界存在的压力差，蒸汽可将氨带出。故蒸馏时，要保证蒸汽均匀、充足，中间不能停止加热，防止发生倒吸；

⑩蒸馏前如果加碱后消化液呈蓝色而没有生成氢氧化铜沉淀，说明加入的碱量不足，需要适量补加碱；,蒸馏时为防止水蒸气发生器内液体爆沸，加入几片碎瓷片或大的玻璃珠，玻璃珠直径最好大于联通的玻璃管直径，以免玻璃珠进入玻璃管内影响蒸汽均匀、充足的输出；-冷凝管下端要插入硼酸吸收液液面以下，防止氨逸出，蒸馏完毕后先将冷凝管下端提离液面，再蒸1 min后清洗管口，再移开吸收瓶，最后关掉热源，否则可能发生倒吸。

氮含量与蛋白质含量的折算：

蛋白质主要由氨基酸构成，不同种类氨基酸的氮含量不同，因此计算含氮量和蛋白质含量时需根据实际情况选取适当的折算系数，否则会带来很大的误差。例如，一-些小分子的氨基酸、碱性氨基酸、氨基酸酰胺等氮元素的含量高于平均水平，如果待测样品中这类的氨基酸含量较高，为测量的准确性需要调整折算系数，否则会导致计算结果比真实的含氮量高。在标准中给出测最时计算的表达式如式(1) :

使用公式要根据待测样品的种类选取合适的F值，具体取值情况如下: 一般食物F=6.25；纯乳与纯乳制品F=6.38；面粉F=5.70;玉米、高粱F=6.24；花生F=5.46；大米F= 5.95；大豆及其粗加工制品F=5.71；大豆蛋白制品F=6.25；肉与肉制品F= 6.25；大麦、小米、燕麦、裸麦F=5.83；芝麻、向日葵F=5.30；复合配方食品F=6.25。

多次测量取平均值减小偶然误差：

整个测量中涉及大量试剂的配制使用，操作与读数，各种环境因素的干扰等，这些都会使测量中产生偶然误差，因此在蛋白质含量的测量中，最终测量结果需要进行多次重复性试验，并将得到的结果取算数平均值表示，以此减小测量的偶然误差，并且如果待测样品蛋白质的含量即:X≥1 g/100 g，其结果需要保留三位

有效数字:如果待测样品蛋白质的含量即: X<1 g/100 g,其结果只需要保留两位有效数字即可。

通过凯氏定氮法的基本原理与操作步骤可发现，使用该方法检测时，第一步消化的本质是将样品中的氮元素全部转化生成硫酸铵，即凯氏定氮法测量的是被测样品中有机物中含有氮元素的总量，因此该办法并无法消除样品中其他有机物中含有的氮元素对测量结果的影响，如尿素、三聚氰胺等。当年三鹿公司使用的蛋白质检测方法便为凯氏定氮法，最终未能检测出原料中的三聚氰胺而导致食品安全事件。除去样品中非蛋白质部分有机物中氮元素对整个测量的影响，要先去除非蛋白质中的氮元素再进行具体测量，或用其他方法测出非蛋白质中的氮含量，再用总氮含量减去该值再进行折算。

本文围绕蛋白质纯度的重要性，阐述了蛋白类杂质的检测方法，包括电泳法，色谱法，沉降速率测定法，质谱法，光散射法。任何方法都不能直接定量蛋白质样品的纯度。无论最终目的是为了解释分析数据、验证过程质量，还是为了确保生物制剂产品的安全性，样品纯度的测定都是至关重要的环节。

随着蛋白类生物制品的发展，蛋白质纯度已经成为药品管理的重大问题。在生物制品的质量指导原则中指出：除了评价原料药和药物产品的纯度，可能由预期产品和多种产品相关物质组成之外，还应评价可能出现的杂质成份。这些杂质可能是在生产过程中产生的或者是与产品相关，它们的结构可能是已知的、定性的，亦或是未知的。

在评价样品纯度之前，首先要鉴定待测杂质的类型，如核酸、碳水化合物、脂质、无关蛋白质、同工酶类、失活蛋白质，进而确定在待测溶液中，能够区分假定杂质和目标蛋白质的理化性质(化学分析或物理特征)。纯化过程中可能已将某一杂质的浓度降低到检测限以下，但色谱峰中还有残留。毫无疑问，表观纯度取决于所选择的测定方法及其灵敏度。大多数的分离方法都能有效的去除非蛋白类杂质，下面简单介绍蛋白质样品中蛋白类杂质的检测方法。

电泳法最简单、成本最低，并且在确定样品中蛋白质组分数目方面灵敏度最高，因此最为常见。通常被用于蛋白质纯度鉴定的第一步筛选，甚至应用于初期高异质性的样品鉴定。如果预期杂质与目标蛋白的分子量有差距，SDS凝胶电泳可以分辨出杂质。对于分子量相近但氨基酸组成不同的分子，SDS凝胶电泳一般分不开，但在非变性凝胶电泳中可以根据其不同的电泳迁移率进行鉴定。

然而，在采用该方法时也需要注意一些潜在的问题。对于变性凝胶，可能出现假阴性和假阳性现象。如果发生杂质共迁移或杂质无法进入凝胶的情况，会出现假阴性。因此应该将整块胶，包括浓缩胶和分离胶都染色，并且需要检验蛋白质燃料是否合适。而假阳性的产生，可能是由于在样品制备时发生共价修饰，或者胶不均一或氧化剂残留。同时在非变性凝胶中也会出现类似问题。如果杂质的静电荷为零或者与目标蛋白相反，杂质将不会出现在胶上，可以通过加宽非变性凝胶电泳的PH范围来解决。

2.1 凝胶过滤色谱法

凝胶过滤色谱法是检测与目的蛋白分子量大小不同杂质的最简单方法之一。此方法无破坏性并且非常快速。因为此方法为样品区分法，样品通过凝胶柱时会被稀释，因此检测的样品需要有一定的起始浓度。而具体的检测量则取决于检测杂质时的灵敏度。

凝胶过滤色谱法检测分子大小的灵敏度低于电泳法，实验需要的材料量大于电泳法。由于凝胶过滤色谱通常在天然状态下进行，结果可以反映样品的异质性。但如果蛋白质以稳定的寡聚物形式存在(如脂肪酸酶)，在凝胶过滤色谱时将表现出异质性。同时，快速、可逆自联作用的蛋白质也会表现出异常浓度的洗脱谱。在出现这样情况的时候，可以从不对称或加宽峰中选取不同部分来重复凝胶过滤色谱。

2.2 反相高效液相色谱法

反相高效液相色谱法（reversed phase HPLC），是利用如改性硅介质等非极性基质作为固定相，通过流动相中的有机溶剂减少了蛋白质与固定相的亲和力，进行极性递减的梯度洗脱，从而将蛋白洗脱下来。

由于该方法简单并且迅速，同时有现成的仪器设备，能够灵活应用于多种不同特性的蛋白质分离，因此此方法已普遍用于蛋白质样品的纯度测定。如果有需要，还可以通过改变流动相使样品在不同梯度及条件下分离，来确定主要目标物的纯度。

沉降速度法，能够简单并且快速非破坏性的来测定蛋白质的纯度，同时对分子质量和分子大小的比值非常灵敏。该方法的优点在于，测定范围非常的广；但局限在于，对相对分子质量相差小的样品做测定时，灵敏度低于电泳技术。

质谱法可以直接测定一个样品中共价质量的分布，此方法能够方便简便、灵敏的测定杂质。质谱法不仅可以检测杂质的存在，还可以描述杂质的质量特征，因此质谱法常被用于鉴定杂质的来源。通过串联质谱法（MS/MS），可以鉴定共价改性修饰特征和位点。由于杂质可能与主要目标物有相似的质荷比，将质谱法与其他方法(如凝胶分离色谱)联用，可以增加样品纯度测定的准确性，达到最佳的效果。

目前一些仪器能够通过静态或动态光散射来测定单个样品，或者监测高效液相色谱和场级分离过程。通过对分子大小和表观分子质量的连续测定，增强鉴定洗脱蛋白质的能力，以区分待分析物、待分析物的多聚体或杂质。光散射法非常简单且无破坏性，同时能够提供洗脱时间函数的分子质量图。如果紫外检测峰不对称，通过多角度光散射（multiple angle light scattering，MALS）分析，有可能表现峰的主要部分表观分子量为mol/L，而边缘为2mol/L，说明可能存在二聚体。但出现倍数分子质量不一定能证明一定存在自身结合，还需要采用不同的方法验证此结果.

任何方法都不能直接定量蛋白质样品的纯度。通常情况下，蛋白质纯度测定涉及评价待定杂质的含量或仅仅验证蛋白质样品中是否存在杂质。无论最终目的是为了解释分析数据、验证过程质量，还是为了确保生物制剂产品的安全性，样品纯度的测定都是至关重要的环节。

本文整理自：食品理化检测、中科森辉微球，感谢分享！