自酶切割后却发现目的蛋白没有活性。请我现在手头有个融合蛋白，纯化的时候用助溶剂溶解后做了GST亲和层析，之后用蛋问有哪些可能会出现这种原因？怎么解决？测过基因序列，没有问题。细胞破碎后，融合蛋白在沉淀里，我用助溶剂提取后，可以用GST做亲和层析，但效率只有50～60％左右。洗脱完融合蛋白不需要助溶剂，但这样的条件下切割完后目的蛋白会沉淀，我用

有的，到时候发给你吧。琼脂糖肯定比纤维素分离效果要好，载量也大，还有就是柱床体积不会变化，流速高。

70)    想请较：质粒纯化中超螺旋和线性的如何实现有效分离（制备规模），且不使用plasmidselect之类亲和介质。

亲和是最有效的方法，我们有现成的工艺，包括去内毒素，你可以把你的邮件pM给我，我给你发一份相关的材料，你可以看看。

71)    我所纯化的蛋白质大概是66kDalton，进行的亲和纯化。现在出现几个问题想请教：

1。用的Ni-NTA进行亲和纯化，以前一直是在250mM咪唑中洗下目标带，现在50mM就有，是不是我的镍柱不太好使。

2。因为亲和纯化后我的蛋白在最上面，所以我现在用sephadex G－100，但是我发现效果很差，不仅回收率低，而且也只有小分子量的杂带能去掉。因为在我的目标带下面不久就有一个小的杂带，而且我想把我的蛋白去结晶，那样要求的纯度就很高。这样的话是不是选用的纯化材料不对，而且对于流速和柱子长度要求就很严格了。

有可能你的载量下降了，所以才那样，你需要清洗了。

我觉得你最好选择新的填料，其实你要是条件好的话，仅一步就可以纯化到95%，我可以把我们的方法告诉你，你pM你的邮件给我就好了。

column 上了，100％的ACN都没办法洗下来，异丙醇也试过了，还有什么好方法？

2。在跑RP-HPLC的时候，如果样品的盐浓度太高了，有影响么？

那实在不型可以考虑极性更低的乙酸乙酯等物质.此外洗不下来有没有可能变性沉淀在柱子上下不来,你的100％的ACN里面有三氟乙酸吗,我觉得出不来的原因有不少,不一定仅是洗脱的问题,所以用反相分离蛋白还是得很小心,此外不知道你的柱子是不是专门用于纯化蛋白的,因为孔径太小也不适合分离蛋白.

洗么？不过在用isopropanol洗的时候，会有一些峰，但好像总是洗不干净
column 是专门用来纯化蛋白的，是C4。 不知道孔径是多少，不过C4的应该都差不多把。

我觉得如果是沉淀也有可能,要不你就少上点样,或者降低上样的浓度,此外尽量洗脱要快点,用变性剂怕不是好的方法,因为浓度太高,很容易有变性剂析出,这样堵柱子或管道更麻烦,你可以开始就增加点ACN 的浓度,这样吸附力弱点,你也可以添加点极性小的溶剂,这样可以避免吸附力太强而洗脱困难.我想柱子应该没有问题.方法也没有错.

这个可真的没有做过,不过一般的做法都是匀浆,然后用缓冲液提取,不知道你的是什么来源的样品,此外如果脂肪含量高可以先用冷的丙酮脱脂肪后再提取,我想细胞外基质中的蛋白也应该是用这些方法吧.

聚乙二醇是没有紫外吸收的,所以没有检测波长,即使有吸收,那也只在210nm附近有弱末端吸收,而很多物质在这个波长都会有吸收,所以检测它怕是不容易.

你用透析或超滤试试吧,还有个方法是用冷的丙酮沉淀蛋白,这样表面活性剂还是溶解的,这样也可以去除.

用冷的丙酮沉淀蛋白，那么丙酮容易去掉吗？如果试试superfine g-25脱盐的方法去掉triton，可行吗？

丙酮很好去,很容易挥发走了,你也可以用除盐柱子去除,但是如果它是和SDS一样能和蛋白结合,那用通常这些除盐,透析,超滤都没有办法去除,只能用沉淀的办法,而且是用酸性丙酮沉淀才能去除.

maleimide应该有紫外吸收的,你可以用紫外分光光度器去做全波长扫描,然后可以找到它的特征吸收峰,用这个波长做检测波长就可以,一般的HPLC带二极管列阵检测器也可以做全波长扫描,或者你选几个波长做HPLC也可以,只要没有干扰就可以了.

我现在想纯化一种蛋白，我的蛋白是14kD的碱性蛋白质，流程是这样的：原核细胞内蛋白表达，裂解细胞，SP-sepharose盐离子层析，HPLC Mono S过柱，去盐，HPLC C18过柱，最后得到纯化的蛋白。上面是一个成熟的protocol，我一直没有做过蛋白纯化，所以想向斑竹请教，HPLC上样量这么小，我有5ml的量，要多久才完成？

我觉得为什么要用两次强的阳离子交换柱子呢,直接过一步Source 15 S应该也可以,这样可以省去一步,而后再上HPLC,其实如果你的纯化如果做得好,不上HPLC也有可能,除非你们这个蛋白要求纯度很高,HPLC也有大的柱子,1X25CM的,一次上样可以. 关于浓缩的方法，冷冻抽干法、PEG、蔗糖、硫酸胺沉淀法各有何优劣？冷冻抽干法和硫酸胺沉淀法会不会破坏蛋白的活性？蔗糖会不会影响后续的超滤?

我纯化的第二个蛋白质，是经过酶催化的该复合物（110KD），这里纯化的目的主要是去除体系中未组成复合物的单个亚基（36KD、13KD、1KD）及36KD亚基的aggregate，国外的protocol推荐用凝胶层析，但我询问做过的人说分离的效果并不理想（原因不清），我是应该优化凝胶层析的步骤还是应该选用其它的层析方法？没有蠕动泵和收集器（只有层析柱和低温冰箱）能不能做凝胶层析?如果能做如何尽量提高其分离效果？选择层析柱和填料有哪些原则和注意事项?

Native-PAGE时，样品的盐离子浓度和样品内的其它蛋白质会不会影响电泳结果呈阴性？Native-PAGE和一般SDS-PAGE不同之处是否仅仅在于：　凝胶和电泳、上样缓冲液中不加SDS；样品中不加DTT或β-巯基乙醇，不经100℃煮沸处理；电泳时保持较低的温度(4℃)？

问题多多，实在是因为本人是初次涉及蛋白质纯化领域的门外汉，除了您推荐过的书，您还能不能推荐一些专门的网站、公司的操作手册（您如果有买了产品才能获得的，能否也EMAIL惠赠？）谢谢！！！

别客气,有沉淀也许是蛋白在那样的pH下溶解度不好,或者因为缓冲液的原因,挂不住会不会是没有切开,所以挂不柱.最好用电泳看看切的效果如何.

至于破碎我不很清楚,酶切你可以参考下面的东西:

只能在离子交换, 凝胶过滤, 疏水中去试吧.这么低的含量,先建立好的检测方法最要紧.

我没做过层析,我想纯化经胃蛋白酶消化的血浆蛋白, 使产物F(ab')2含量达到80%以上. 现在的工艺F(ab')2含量在45-65% . 请教大规模层析方案. 一次处理量为100万毫升,

我觉得可以在疏水和离子交换的办法中去试.你的样品中主要的杂质是白蛋白和IgG吧,你也可以把这些物质去掉达到去除杂质提高纯度的目的.

你查一篇文献就知道了,比较简单,就是低浓度的乙腈水加三氟乙酸平衡柱子,然后在用高浓度的乙腈水加三氟乙酸线性剃度洗脱,基本就这样,具体的浓度要自己看你蛋白特性而调整了.不少HPLC的文献都有具体的方法.

今天花了一个晚上浏览，收获蛮大，我的问题是这样：纯化GST融合蛋白（加上GST共90kD多），用amersham的1ml柱，曾经纯化出来，但酶切后就不见目的蛋白，只见GST，这次更悬，没有加凝血酶切，但洗脱柱后就在GST大小附近有带，菌液预先小量诱导有目的条带（90kD，没有GST条带），不知道是什么原因，诱导条件：

2,如果样品体积相对于上样量太大您比较常用的浓缩方法是什么?我有透析袋,PEG ,大容量冷冻干燥设备和50ml的脱盐柱,很小的超滤管可供选择.

3,我依次用离子柱,疏水柱,亲和柱纯化我的蛋白.过了离子柱之后,我发现不挂柱的部分和梯度洗脱下来的某一部分都能检测到活性(我提纯天然酶),这可不可以说明他们是不同蛋白? 我把在离子柱上梯度洗脱下来的那一部分再经过疏水柱之后上亲和柱(染料,red),用2M的盐洗,发现在小于1M和接近2M的地方有两个活性峰,这能不能说明这又是不同的蛋白?最终SDS-PAGE发现这"两个"条带分子量相差一点点,但是按照文献上应该只有一个活性很强的蛋白,我却得到这样活性很弱的"两个"蛋白,真是越做越糊涂了.

超滤设备当然有大的，你可以和密理博或者颇尔公司联系，他们会给你详细回答的，我做纯化大多用疏水和亲和多，所以不怎么浓缩，小量可以用透析袋，大量的可以用超滤，如果要做成粉末长期保存那就冷冻干燥。

不挂的部分不一定是另一种酶，因为柱子不可能是100%挂 住，何况超载时穿透也会有活性，还是用电泳检测看是不是在同一个位置都有。洗脱做电泳差一点很难说，因为电泳的带不一定对得很齐，你把两个样品混在一起 跑，这样看是不是一条带，如果是很可能还是一个东西，活性的强弱得看你操作本身有没有降低活性的可能，如果是这样，那说明在纯化过程中有活性损失，染料亲 和有洗脱需要特异洗脱，例如用辅酶洗脱的，你看你的操作和文献是不是一样，此外提取有没有问题，还有是不是浓度太低所以活性低。

我要做的His融合蛋白是细胞表达后提取出来的，上样体系是否要和柱子平衡体系一样呢？因为没有检测器，请问大概要用多大浓度的咪唑来洗脱？

我们公司的镍琼脂糖凝胶是已经螯合好镍了，不知道你用的是哪家公司的，一般如果是蓝绿色的，那是螯合好镍了，如果是白色的，那就没有，再生很难在这里说清楚，你PM你的邮件地址给我，我把我们的材料发给你，很详细，包括操作也是，样品最好是pH和盐浓度同平衡缓冲液一样，一般你买的填料都有说明书，就有怎么操作的，我可以把我们的操作发一份给你做参考。不同蛋白洗脱都不一样，你看我们的说明书就比较清楚了。

FF,串联体裂解成单体后，由于单体分子量4000左右，PI和原来差不多，所以想重复串联体一样在进行纯化。

我没做过纯化，以上想法是否行得通，请兄台指教，

若学长有更好的想法请尽管不吝赐教。G-25除盐速度快吗？操作条件：平衡，洗脱液，柱的大小，都望指教

如果你的样品等电点是 非常感谢您！

抗体这样纯化的方法我没有做过,你可以参考下面的帖子,我也有相关的材料,其实硫酸铵沉淀后直接过苯基柱子就效果很好,直接过亲和也可以,你这个方法文献虽然说,但看来不一定好用,我怀疑还是操作的条件.

你需要偶联什么东西来纯化抗体呢,是你的抗原吗,我把材料发给你吧,其实纯化抗体方法不少,看你的需要了.

看你蛋白情况了,一般也就2M左右吧.挂不住就提高浓度,挂太牢就适当降低盐浓度,一般要根据实验决定.我一般就用苯基琼脂糖凝胶,一般纯化IgG用.谢谢!

这样小的多肽最好是用反相色谱去制备,这是最快的方法,如果没有条件,那就先超滤,然后再进一步纯化,方法可以用离子交换,反相,疏水.

本人也做过多年纯化，但是很惭愧，经验还是少得很。我目前正在作产品研究，正像你说的那样，确实也是难度很大，我目前最大的问题也是一个酸性蛋白的去热源问题，对你的除热源柱非常感兴趣，请把这方面的资料包括价格给我一份吧。还有，我希望能有34um的敖和介质，不知你们能不能做，PHARMACIA的是太贵了。还有GLUTATHIONE 亲和介质。当然，我使用的介质很多，其他你们有的介质资料也发给我吧。

你别客气,我其实也是和大家交流,共同提高而已, 酸性蛋白去热源和核酸去热源是一样的,都是酸性的物质, 所以想用阴离子交换的方法去是很难的, 我们用我们去内毒素的填料解决了我们核酸去内毒素的问题, 现在有几家药厂用我们的填料, 也解决了困惑他们的热源问题. 至于34um的敖和介质效果和90um的没有什么差别, 没有必要, 我用过200um的都一样用, 亲和的填料对颗粒要求不高, 如果不是用线性洗脱而改用阶段洗脱效果一样很好,这样根本不用考虑可颗粒大小,我把我们的材料发给你一份,希望有所帮助.

C-25装柱前的预处理，谢谢！

不需要特别处理,其实只要是新的填料直接平衡就可以用.说明书上应该都有.