1、测定原理提取样品中山梨酸及其盐类,经硫酸重铬酸钾氧化成丙二醛,再与硫代巴比妥酸形成红色化合物,其颜色深浅与丙二醛含量成正比,可于530nm处比色定量。2、试剂(1)重铬酸钾硫-硫酸溶液:0.1mol/L重铬酸钾与0.15mol/L硫酸以1:1混合备用。(2)硫代巴比妥酸溶液:准确称取0.5g硫代巴比妥酸于100mL容量瓶中,加20mL水,加10mL1mol/L氢氧化钠溶液,摇匀溶解后再加1mol/L盐酸11mL,以水定容(临时用配制,6h内使用)。(3)山梨酸钾标准溶液:准确称取250g山梨酸钾于250mL容量瓶中,用蒸馏水溶解并定容(本溶液山梨酸含量为1mg/mL,使用时再稀释为0.1mg/mL)。3、仪器分光光度计;组织碎机;10mL比色管。4、操作方法(1)样品处理

1.本发明属于食品加工技术领域，具体涉及一种肌浆蛋白肽糖基化接枝物的制备方法及其在制备发酵肉松酱中的应用。

2.目前，市场上销售的肉松酱种类越来越多，口味也多种多样，其营养丰富，易被人体消化吸收，食用方便，逐渐成为一种佐餐佳品。但是，肉松酱因富含蛋白质和脂肪，在贮藏过程中极易被氧自由基攻击而发生氧化，进而破坏肉松酱品质，影响食用安全性。
3.蛋白质的糖基化改性是基于美拉德反应机理的羰氨缩合反应，该过程不需任何化学催化剂参与，通过自发的美拉德反应即可使蛋白质分子的ε-氨基与糖分子的还原性末端羰基进行共价结合而实现，所得到的蛋白质-糖共价复合物常可作为性质优良的多功能添加剂。因其反应条件温和、安全性高而倍受瞩目。
4.目前虽然也有关于蛋白肽的糖基化改性提高抗氧化能力的研究，比如，赵玉滨利用碱性蛋白酶水解芸豆蛋白再通过糖基化反应制备芸豆肽糖基化改性物，其自由基清除能力和还原能力得到显著提高。尤娟采用五种蛋白酶酶解鲢鱼肉蛋白制备抗氧化肽，再经糖基化反应制备得到有较好清除dpph自由基能力和还原力的产物。中国专利cnb公开了一种糖基化蜂王浆抗氧化肽及制备方法，其是将碱性蛋白酶酶解后的蜂王浆蛋白肽进行糖基化改性来提高蜂王浆蛋白肽的抗氧化活性。然而，目前未见利用乳酸菌发酵蛋白质制备肽再进一步经糖基化反应制备接枝物的报道。而且现有技术也只是停留在改善蛋白肽糖基化接枝物功能特性的研究上，还未见将糖基化产物成功应用于肉松酱的制备并显著增强其抗氧化能力以及氧化稳定性的相关报道。

5.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种肌浆蛋白肽糖基化接枝物的制备方法及其在制备发酵肉松酱中的应用，采用本技术提供的制备方法操作简单，得到的肉松酱具有很强的抗氧化性和氧化稳定性，在贮藏期内具有更好的挥发性风味物质保持率。
6.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
7.本发明提供了一种肌浆蛋白肽糖基化接枝物的制备方法，包括以下步骤：
8.将鱼肉与磷酸盐缓冲液混合匀浆后进行第一次离心，得到上清液；
9.将所述上清液与乳酸混合后进行第二次离心，收集沉淀物，得到肌浆蛋白；
10.将所述肌浆蛋白与含有葡萄糖的磷酸盐缓冲溶液混合，得到肌浆蛋白溶液；
11.将所述肌浆蛋白溶液进行发酵，得到肌浆蛋白肽液；
12.将所述肌浆蛋白肽液与糖类混合，进行糖基化反应，得到肌浆蛋白肽糖基化接枝物。
13.优选的，所述糖基化反应的反应温度为50～70℃，反应时间为90～150min。
14.优选的，所述糖类包括木糖和海藻糖；所述木糖和海藻糖的质量比为(1～3)：(1～3)。
15.优选的，所述发酵用菌的接种量为肌浆蛋白溶液质量的0.05～0.25％；所述发酵用菌包括嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌；所述嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的质量比为95:5；所述发酵用菌的总活力为250danisco单位。
16.优选的，所述发酵的发酵温度为40～45℃，发酵时间为10～15h。
17.优选的，所述鱼肉取自但不限于冷水鱼的背部肌肉；所述冷水鱼包括腹鱼、鲟鱼和鲑鳟鱼中的一种或几种。
18.本发明还提供了利用前述技术方案所述制备方法制备得到的肌浆蛋白肽糖基化接枝物，所述肌浆蛋白肽糖基化接枝物中固形物含量为25％～35％，接枝度为30％～40％。
19.本发明还提供了一种利用前述技术方案所述肌浆蛋白肽糖基化接枝物制备发酵肉松酱的方法，包括以下步骤：
20.将肉松与肌浆蛋白肽糖基化接枝物混合，得到肉松-肽糖基化接枝物混物；
21.利用发酵乳杆菌对所述肉松-肽糖基化接枝物混物进行肉松发酵，得到发酵肉松酱。
22.优选的，每克肉松-肽糖基化接枝物混物接种106～108cfu发酵乳杆菌。
23.优选的，所述肉松发酵的发酵温度为35～40℃，发酵时间为4～8h。
24.本发明提供了一种肌浆蛋白肽糖基化接枝物的制备方法和发酵肉松酱的制备方法，包括将鱼肉与磷酸盐缓冲液混合匀浆后进行第一次离心，得到上清液；将所述上清液与乳酸混合后进行第二次离心，收集沉淀物，得到肌浆蛋白；将所述肌浆蛋白与磷酸盐缓冲溶液混合，得到肌浆蛋白溶液；将所述肌浆蛋白溶液进行发酵，得到肌浆蛋白肽液；将所述肌浆蛋白肽液与糖类混合，进行糖基化反应，得到肌浆蛋白肽糖基化接枝物。本发明的肌浆蛋白肽糖基化接枝物抗氧化能力强，可减缓肉蛋白质和脂质的氧化速率。本发明将肉松和肌浆蛋白糖基化接枝物混合发酵后，生成了很多具有抗氧化的小分子肽和氨基酸，使得制备的肉松酱在贮藏期间具有较好的抗氧化能力和氧化稳定性，保持了肉松酱的食用品质。在本发明实施例中，利用本发明所述制备方法得到的肉松酱抗氧化能力强，在贮藏期间的氧化稳定性突出，具有更好地挥发性风味物质保持率；且所得肉松酱品质好。
25.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
26.图1为不同发酵鱼松酱在贮藏120d期间的tba值变化结果；
27.图2为不同发酵鱼松酱在贮藏120d期间的羰基值变化结果；
28.图3为不同发酵鱼松酱在贮藏120d期间的dpph
清除能力(％)变化结果；
29.图4为不同发酵鱼松酱在贮藏120d期间的挥发性风味物质变化结果。
30.本发明提供了一种肌浆蛋白肽糖基化接枝物的制备方法，包括以下步骤：
31.将鱼肉与磷酸盐缓冲液混合匀浆后进行第一次离心，得到上清液；
32.将所述上清液与乳酸混合后进行第二次离心，收集沉淀物，得到肌浆蛋白；
33.将所述肌浆蛋白与含有葡萄糖的磷酸盐缓冲溶液混合，得到肌浆蛋白溶液；
34.将所述肌浆蛋白溶液进行发酵，得到肌浆蛋白肽液；
35.将所述肌浆蛋白肽液与多糖混合，进行糖基化反应，得到肌浆蛋白肽糖基化接枝物。
36.本发明将鱼肉与磷酸盐缓冲液混合匀浆后进行第一次离心，得到上清液。在本发明中，所述鱼肉取自但不限于冷水鱼的背部肌肉；所述冷水鱼优选包括腹鱼、鲟鱼和鲑鳟鱼中的一种或几种。在本发明中，所述鱼肉优选以肉糜的形式提供；在本发明中，所述肉糜优选通过去除冷水鱼的鱼头、鱼尾和鱼皮，剖下鱼背部肌肉，绞碎得到。在本发明中，所述磷酸盐缓冲液的浓度优选为0.01～0.03mol/l，进一步优选为0.02mol/l；所述磷酸盐缓冲液的ph值优选为6.8～7.5，进一步优选为6.9或7.0或7.1～7.4。在本发明中，所述肉糜与磷酸盐缓冲液的质量比优选为1:2～6，进一步优选为1：3～5。在本发明中，所述匀浆的时间优选为1～5min，进一步优选为2～3min。在本发明中，所述第一次离心的离心力优选为7000～9000g，进一步优选为8000g；离心时间优选为8～12min，进一步优选为10min。本发明以磷酸盐缓冲液对肉糜进行匀浆，可使肉糜的ph值上升，高于肉蛋白的等电点，从而使肉糜的持水能力得到提高，同时增加离子强度，有利于肌浆蛋白的溶出，还为肌浆蛋白提供了适宜环境。
37.得到上清液后，本发明将所述上清液与乳酸混合后进行第二次离心，收集沉淀物，得到肌浆蛋白。在本发明中，所述乳酸的体积浓度优选为1～4％，进一步优选为1.5～3.5％，更优选为2％；所述乳酸与上清液的体积比优选为(1～4)：1，进一步优选为2:1。在本发明中，所述第二次离心的离心力优选为7000～9000g，进一步优选为8000g；离心的时间优选为8～12min，进一步优选为10min。本发明所述乳酸的作用是沉淀肌浆蛋白。
38.得到肌浆蛋白后，本发明将所述肌浆蛋白与含有葡萄糖的磷酸盐缓冲溶液混合，得到肌浆蛋白溶液。在本发明中，所述磷酸盐缓冲液的浓度优选为0.01～0.03mol/l，进一步优选为0.02mol/l；磷酸盐缓冲液的ph值优选为6.8～7.5，进一步优选为6.9或7.0或7.1～7.4。在本发明中，所述磷酸盐缓冲溶液中的葡萄糖含量优选为0.5％～2％，进一步优选为1％。在本发明中，所述葡萄糖为后续菌种发酵提供碳源。在本发明中，所述肌浆蛋白溶液的蛋白质质量分数优选为5％～10％，进一步优选为7％～9％。混合后，本发明优选还包括将所述肌浆蛋白溶液进行水浴灭菌，冷却，得到肌浆蛋白溶液。在本发明中，所述水浴灭菌的温度优选为90～95℃，进一步优选为92～94℃，所述水浴灭菌的时间优选为5～10min，进一步优选为6～9min。本发明所述冷却包括将肌浆蛋白溶液冷却至40～45℃。本发明将所述肌浆蛋白溶液的蛋白质质量分数控制在5％～10％有利于提高接枝度。
39.得到肌浆蛋白溶液后，本发明将所述肌浆蛋白溶液进行发酵，得到肌浆蛋白肽液。在本发明中，所述发酵用菌的接种量优选为肌浆蛋白溶液质量的0.05％～0.25％，进一步优选为0.1％～0.2％；所述发酵用菌优选包括嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌；所述嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的质量比为95:5；所述发酵用菌的总活力为250danisco单位。在本发明的实施例中，具体采用嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌直投式混合菌粉。在本发明中，所述发酵的发酵温度优选为40～45℃，进一步优选为41～43℃，发酵时间优选为10～15h，进一步优选为11～13h。本发明将肌浆蛋白溶液发酵的目的是使肌浆蛋白在乳酸菌分泌的蛋
白酶和肽酶作用下生成肌浆蛋白肽。
40.在本发明中，所述嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌直投式混合菌粉为常规购置，购自danisco公司。
41.得到肌浆蛋白肽液后，本发明将所述肌浆蛋白肽液与糖类混合，进行糖基化反应，得到肌浆蛋白肽糖基化接枝物。在本发明中，所述肌浆蛋白肽液的ph值优选为7.0～8.5，进一步优选为7.5～8.0。在本发明中，所述糖类的质量优选为肌浆蛋白肽液质量的1％～7％，进一步优选为2％～5％。在本发明中，所述糖类优选包括木糖和海藻糖；所述木糖和海藻糖的质量比优选为(1～3)：(1～3)，进一步优选为2:3。在本发明中，所述糖基化反应的温度优选为50～70℃，进一步优选为55～65℃，反应时间优选为90～150min，进一步优选为100～140min。所述肌浆蛋白肽糖基化接枝物的接枝度优选为30％～40％。本发明通过限制糖基化反应的温度、时间以及糖的种类来实现30％～40％的接枝度。本发明将肌浆蛋白肽液的ph值调节到7.0～8.5，目的是为糖基化反应创造良好的环境。本发明所述肌浆蛋白肽糖基化接枝物的接枝度在30％～40％时，抗氧化的能力较强。
42.所述糖基化反应后，本发明优选还包括将糖基化反应料液冷却至室温，进行真空浓缩，得到肌浆蛋白肽糖基化接枝物。本发明进行真空浓缩时，对于浓缩的倍数没有严格要求，保证浓缩后，肌浆蛋白肽糖基化接枝物中的固形物含量为25％～35％即可。
43.本发明还提供了利用前述技术方案所述制备方法制备得到的肌浆蛋白肽糖基化接枝物；所述肌浆蛋白糖基化接枝物固形物含量为25％～35％，接枝度为30％～40％。
44.本发明还提供了一种利用前述技术方案所述肌浆蛋白肽糖基化接枝物制备发酵肉松酱的方法，包括：将肉松和肌浆蛋白肽糖基化接枝物混合，得到肉松-肽糖基化接枝物混物；利用发酵乳杆菌对所述肉松-肽糖基化接枝物混物进行肉松发酵，得到所述发酵肉松酱。
45.本发明可以采用肉松市售产品也可以自行制备；本发明采用自行制备的方式提供肉松时，所述肉松的制备方法包括：肉中加入食盐、姜粉和六偏磷酸钠，进行腌制、蒸煮、挑出鱼刺和炒制，得到肉松。
46.按照重量份计，每100份肉中，优选加入食盐1.00～3.00份，进一步优选为2.0份；优选加入姜粉0.10～0.15份，进一步优选为0.14份；优选加入六偏磷酸钠0.10～0.30份，进一步优选为0.2份。在本发明中，所述腌制的温度优选为2℃～6℃，进一步优选为4℃。
47.在本发明中，所述蒸煮的时间优选为30～50min，进一步优选为35～45min。在本发明中，所述炒制优选在铁锅中进行。本发明所述肉松中含水量优选为20％～35％，进一步优选为25％～30％。所述食盐的作用是调味，姜粉的作用是去腥，六偏磷酸钠的作用是保水。本发明肉松中含水量为25％～30％时口感最佳，耐保存。
48.在本发明中，所述肌浆蛋白肽糖基化接枝物的添加重量优选为肉松重量的50％～60％，进一步优选为53％～57％。
49.得到肉松-肽糖基化接枝物混物后，本发明利用发酵乳杆菌对所述肉松-肽糖基化接枝物混物进行肉松发酵，得到所述发酵肉松酱。本发明对所述发酵乳杆菌的来源没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的即可。在本发明的实施例中，采用发酵乳杆菌sicc 1.366，购自四川省微生物资源平台菌种保藏管理中心。
50.在本发明中，所述发酵乳杆菌的接种量优选为每克肉松-肽糖基化接枝物混物接
种106～108cfu，进一步优选为107cfu。在本发明中，对肉松-肽糖基化接枝物混物进行发酵的温度优选为35～40℃，进一步优选为37℃；时间优选为4～8h，进一步优选为5～6h。本发明通过将肉松和肌浆蛋白糖基化接枝物混合后发酵，发酵乳杆菌在发酵过程中产生的特异性蛋白酶和肽酶，可作用于底物生成很多能够抗氧化的小分子肽和氨基酸，使得制备的肉松酱具有更强的抗氧化能力，贮藏时间长。
51.得到发酵肉松酱后，本发明优选还包括将发酵肉松酱灌装于玻璃瓶中，密封后于121℃反压杀菌30min，得到发酵肉松酱成品。
52.为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的肌浆蛋白肽糖基化接枝物的制备方法和发酵肉松酱的制备方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
54.去除冷水鱼的鱼头、鱼尾和鱼皮，剖下鱼背部肌肉，绞碎，得到肉糜(200g)，加入4倍质量的浓度为0.01mol/l，ph为7.0的磷酸盐缓冲溶液，匀浆2min，在8000g/10min的条件下，进行第一次离心，获得上清液。在上清液中加入体积分数为2％的乳酸(乳酸体积为上清液体积的2倍)混合，在8000g/10min的条件下，进行第二次离心，得到肌浆蛋白(约10g)。
55.将肌浆蛋白溶解于含有1％葡萄糖的0.01mol/l磷酸盐缓冲溶液中，配制成蛋白质质量分数为5％的肌浆蛋白溶液，90℃水浴灭菌5min，冷却至40℃。按照肌浆蛋白溶液质量的0.15％加入嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的直投式混合菌粉(嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的质量比为95:5，总活力为250danisco单位)，于42℃条件下发酵12h，得到肌浆蛋白肽液。
56.调节肌浆蛋白肽液ph至7.5，按肌浆蛋白肽液重量的3％加入木糖和海藻糖混合物(木糖和海藻糖的重量比为2:3)，进行糖基化反应，反应温度为60℃，反应时间为130min。冷却至室温，真空浓缩至固形物含量为30％，得到肌浆蛋白肽糖基化接枝物。
58.将冷水鱼的背部肌肉切成4cm长的鱼片，按照重量比，每100份鱼肉加入食盐2.0份、姜粉0.14份和六偏磷酸钠0.2份，4℃腌制6h。腌制好的鱼片在100℃蒸煮40min。挑出鱼刺后，在炒锅中炒至鱼肉含水量为30％，得到鱼松。
59.按鱼松重量的55％加入肌浆蛋白肽糖基化接枝物，混匀后，得到鱼松-肽糖基化接枝物混物。按照每克鱼松-肽糖基化接枝物混物接种107cfu发酵乳杆菌sicc 1.366，搅拌均匀，37℃恒温发酵5h，得到发酵鱼松酱。将发酵鱼松酱灌装于玻璃瓶中，密封后于121℃反压杀菌30min，得到发酵鱼松酱成品。
61.同实施例1-1，区别在于木糖和海藻糖的质量比为1：3。
63.同实施例1-2，区别在于采用的是实施例2-1制备的肌浆蛋白糖基化接枝物。
65.同实施例1-1，区别在于木糖和海藻糖的质量比为3：1。
67.同实施例1-2，区别在于采用的是实施例3-1制备的肌浆蛋白糖基化接枝物。
69.同实施例1-1，区别在于木糖和海藻糖的质量比为1：1。
71.同实施例1-2，区别在于采用的是实施例4-1制备的肌浆蛋白糖基化接枝物。
73.同实施例1-1，区别在于糖基化反应的反应温度为50℃，反应时间为90min。
75.同实施例1-2，区别在于采用的是实施例5-1制备的肌浆蛋白糖基化接枝物。
77.同实施例1-1，区别在于糖基化反应的反应温度为70℃，反应时间为150min。
79.同实施例1-2，区别在于采用的是实施例6-1制备的肌浆蛋白糖基化接枝物。
81.同实施例1-1，区别在于发酵用菌的接种量为肌浆蛋白溶液质量的0.05％。
83.同实施例1-2，区别在于采用的是实施例7-1制备的肌浆蛋白糖基化接枝物。
85.同实施例1-1，区别在于发酵用菌的接种量为肌浆蛋白溶液质量的0.25％。
87.同实施例1-2，区别在于采用的是实施例8-1制备的肌浆蛋白糖基化接枝物。
91.同实施例1-2，区别在于肌浆蛋白肽糖基化接枝物占鱼松重量的50％。
95.同实施例1-2，区别在于每克肉松-肽糖基化接枝物混物接种106cfu发酵乳杆菌。
97.按照实施例1-1的方式制备肌浆蛋白肽糖基化接枝物，再按照实施例1-2制备发酵鱼松酱成品，区别在于糖基化反应时，加入的糖类为木糖。
99.同对比例1-1，区别在于加入的糖类为海藻糖。
101.同对比例1-1，区别在于加入的糖类为葡聚糖。
103.同对比例1-1，区别在于加入的糖类为壳聚糖。
105.同对比例1-1，区别在于加入的糖类为木糖和葡聚糖，木糖和葡聚糖的质量比为2:
107.同对比例1-1，区别在于加入的糖类为木糖和壳聚糖，木糖和壳聚糖的质量比为2:3。
109.同实施例1-2，区别在于鱼松酱的制备不加入肌浆蛋白肽糖基化接枝物。
111.按照实施例1-1的方式制备肌浆蛋白肽糖基化接枝物，再按照实施例1-2制备发酵鱼松酱成品，区别在于对鱼松-肽糖基化接枝物混物进行发酵的菌种为植物乳杆菌cicc 20265，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。
113.对实施例1-1～8-1、对比例1-1～1-6得到的蛋白肽糖基化接枝物进行接枝度测定，检测方法为邻苯二甲醛(opa)法。准确称取40mg的opa溶于1ml甲醇中，分别加入20％(w/v)十二烷基磺酸钠溶液2.5ml，0.1mol/l硼砂溶液25ml，β-巯基乙醇100μl，混合均匀后用蒸馏水定容至50ml，得到opa试剂。测定时，取opa试剂4ml于试管中，加入200μl固形物含量为30％接枝物，混合均匀后于35℃水浴2min，在340nm处测定溶液吸光值c
，同时作空白对照c0。接枝度(％)＝(c0－c
100。接枝度测定结果如表1和表2所示。
114.表1不同实施例制备肌浆蛋白肽糖基化接枝物的接枝度
116.表2不同糖类制备肌浆蛋白肽糖基化接枝物的接枝度
118.表1和表2表明，利用本发明方法制备的肌浆蛋白肽糖基化接枝物的接枝度为30％～40％，将糖类替换成木糖或海藻糖或葡聚糖或壳聚糖或木糖：葡聚糖＝2:3或木糖：壳聚糖＝2:3后，制备的肌浆蛋白肽糖基化接枝物的接枝度均在25％以下。本发明的方案更有利于提高接枝度。
120.分别对实施例1-1～8-1和对比例1-1～1-6制备得到的蛋白肽糖基化接枝物进行dpph
清除能力和总抗氧化能力测定，检测方法为：1)dpph
清除能力：将0.2mmol/l的dpph溶液(95％甲醇作为溶剂)3ml与固形物含量为30％的1ml接枝物样品或95％甲醇(对照)1ml混合均匀，并在室温下静置20min。经10000
g离心10min，取上清液，于517nm处测定吸光值。dpph
100。2)总抗氧化能力：利用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒，在520nm处检测固形物含量为30％的接枝物的总抗氧化能力，结果
121.表3不同实施例制备肌浆蛋白肽糖基化接枝物的抗氧化能力
123.表4不同糖类制备肌浆蛋白肽糖基化接枝物的的抗氧化能力
125.表3和表4表明，利用本发明方法制备的肌浆蛋白肽糖基化接枝物的dpph
清除能力为62.03％～80.63％，总抗氧化能力为3.67～5.21u/mg蛋白。将糖类替换成木糖或海藻糖或葡聚糖或壳聚糖或木糖：葡聚糖＝2:3或木糖：壳聚糖＝2:3后，制备的肌浆蛋白肽糖基化接枝物的dpph
清除能力和总抗氧化能力均较低，分别为46.02％～60.01％和2.81～3.89u/mg蛋白。
127.分别对实施例1-2～10-2和对比例2～3制备得到的鱼松酱在20℃贮藏第0d、30d、60d和120d时进行tba(硫代巴比妥酸)值、羰基值测定；对实施例1-2和对比例2～3制备得到的鱼松酱在20℃贮藏第0d、30d、60d和120d时进行挥发性风味物质和总抗氧化能力测定，检测方法为：
128.1)tba值测定：取鱼松酱10g于具塞锥形瓶，加入50ml 7.5％三氯乙酸(含0.1％乙二胺四乙酸二钠)溶液，水浴振荡30min，使其充分溶解，并用滤纸过滤2次。吸取5ml滤液于试管中，加入5ml 0.02mol/l的tba溶液，混匀后放入90℃水浴锅中保温40min，取出。冷却后加入5ml三氯甲烷，混匀，静置分层后取上清液，在波长532nm处测定吸光度。tba值以每千克脂质氧化样品中丙二醛的毫克数表示。tba值(mg/kg)＝m2/m1。式中：m1为肉样的质量(kg)；m2为丙二醛的质量(mg)。结果如图1和表5所示。
洗涤3次，将沉淀溶解于3ml盐酸胍溶液中(6mol/l)，并在37℃水浴15min。随后，12000g离心5min，取上清液于370nm处测定吸光度值。羰基含量(nmol/mg蛋白)用摩尔吸光系数22000l/(mol
cm)计算。结果如图2和表6所示。
清除能力：取鱼松酱50g，加入0.01mol/l盐酸200ml高速均浆，然后纱布过滤。在滤液中加入3倍体积乙醇，混匀后离心。取离心后的上清液在旋转蒸发器中回收溶剂。将旋蒸后的样品溶解在0.01mol/l盐酸(25ml)中，用于dpph
清除能力测定。将0.2mmol/l的dpph溶液(95％甲醇作为溶剂)3ml与待测样品1ml或95％甲醇(对照)1ml混合均匀，并在室温下静置20min。经10000
g离心10min，取上清液，于517nm处测定吸光值。dpph
100。测定结果如图3和表7所示。
131.4)挥发性风味物质测定：取鱼松酱1g置于20ml顶空瓶中，压盖密封。将装有涂层厚度为75μm的car/pdms型纤维头的萃取针头通过顶空瓶的密封顶部，在60℃下萃取30min，然后注入gc-ms仪分析。gc条件：db-5ms气相色谱柱；进样口温度250℃，不分流模式；流速为1ml/min的氦气作为载气；升温程序：45℃维持5min，以10℃/min的速度升温至80℃，进一步以5℃/min的速度升温至240℃。ms条件：电离能为70ev，捕获范围为30～450m/z，扫描速率4.5scans/s，获得质谱。鱼松酱中风味物质的鉴定以其保留时间和nist

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抗氧化酶：超氧化物歧化酶或谷胱甘肽过氧化物酶1.1.5 抗氧化物质：还原性谷胱甘肽1.2 人体试食试验1.2.1 脂质氧化产物：丙二醛或血清 8-表氢氧异前列腺素( 8-Isoprostane)1.2.2 超氧化物歧化酶1.2.3 谷胱甘肽过氧化物酶2 试验原则2

2、.1 动物实验和人体试食试验所列的指标均为必测项目。2.2 脂质氧化产物指标中丙二醛和血清8-表氢氧异前列腺素任选其一进行指标测定，验抗氧化酶指标中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶任选其一进行指标测定。2.3 氧化损伤模型动物和老龄动物任选其一进行生化指标测定。2.4 在进行人体试食试验时，应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。3 结果判定3.1 动物实验： 脂质氧化产物、 蛋白质氧化产物、 抗氧化酶、 抗氧化物质四项指标中三项阳 性，可判定该受试样品抗氧化功能动物实验结果阳性。3.2 人体试食试验： 脂质氧化产物、 超氧化物歧化酶、 谷胱甘肽过氧化物酶三项指标中二项 阳性，且对机体健康无

只。1.3.4.1.1.2剂量分组及受试样品给予时间1.3.4.1.1.3实验方法1.3.4.1.2.3.1老龄动物选用 10 月龄以上大鼠或 8 月龄以上小鼠，按血中 MDA 水平分组，随机分为 1 个溶剂 对照组和 3个受试样品剂量组。 3 个剂量组给予不同浓度受试样品， 对照组给予同体积溶剂， 实验结束时处死动物测脂质氧化产

4、物含量、 蛋白质羰基含量、 还原性谷胱甘肽含量、 抗氧化 酶活力。1.3.4.1.2.3.2D 半乳糖氧化损伤模型1.3.4.1.2.3.3原理D-半乳糖供给过量，超常产生活性氧，打破了受控于遗传模式的活性氧产生与消除的 平衡状态，引起过氧化效应。1.3.2.2 造模方法选 25-30g 健康成年小鼠，除空白对照组外，其余动物用D-半乳糖 40mg 1.2g/kg BW颈背部皮下注射或腹腔注射造模，注射量为0.1mL/10g，每日 1 次，连续造模 6 周，取血测MDA ，按 MDA 水平分组。 随机分为 1 个模型对照组和 3 个受试样品剂量组， 3 个剂量组经 口给予不同浓度受试样品， 模

5、型对照组给予同体积溶剂， 在给受试样品的同时， 模型对照组 和各剂量组继续给予相同剂量D-半乳糖颈背部皮下或腹腔注射，实验结束处死动物测脂质氧化产物含量、蛋白质羰基含量、还原性谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。1.3.4.1.2.3.3乙醇氧化损伤模型1.3.4.3.1原理乙醇大量摄入，激活氧分子产生自由基，导致组织细胞过氧化效应及体还原性谷胱甘 肽的耗竭。选用 10 月龄以上老龄大鼠或 8 月龄以上老龄小鼠，也可用氧化损伤模型鼠。单一性别，实验设三个剂量组和一个溶剂对照组，以人体推荐量的10 倍（小鼠）或 5 倍（大鼠）为其中的一个剂量组，另设两个剂量组，高剂量一般不超过30 倍，必要时设阳性对照

6、组、空白对照组。受试样品给予时间30 天，必要时可延长至 45 天。实用标准文档大全1.3.4.3.2造模方法选 2530g 健康成年小鼠（ 180220g 大鼠），随机分为 4 个组， 1 个模型对照组和 3 个受试样品剂量组，必要时可增设 1 个空白对照组。 3 个剂量组给予不同浓度受试样品，模 型对照组给予同体积溶剂，连续灌胃30 天，末次灌胃后，模型组对照组和 3 个剂量组禁食16 小时（过夜），然后 1 次性灌胃给予 50%乙醇 12ml/kgBW ，6 小时后取材（空白对照组不 作处理，不禁食取材） ，测血清或肝组织脂质氧化产物含量、蛋白质羰基含量、还原性谷胱 甘肽含量、抗氧化酶活

7、力。1.3.4.1.2.3.4脂质氧化产物测定1.342.1 血中过氧化脂质降解产物丙二醛（ MDA ）含量测定 血中过氧化脂质降解产物丙二醛（ MDA ）含量可采用荧光法和比色法测定，方法任选 其一。1.3.5.1.1 荧光法1.3.5.3.2荧光法原理MDA （ malondiadehycle ）是细胞膜脂质过氧化的终产物之一，测其含量可间接估计脂 质过氧化的程度。 1 个丙二醛（ MDA ）分子与 2 个硫代巴比妥酸（ TBA ）分子在酸性条件 下共热，形成粉红色复合物。以波长536nm 为激发光，在 550nm 有最强荧光强度。可用荧光法进行微量测定。1.3.5.3.3仪器与试剂 仪器

8、：荧光分光光度计、微量加样器、恒温水浴锅、普通离心机、混旋器、具塞离心管试剂：10mmol/L 四乙氧基丙烷（贮备液，棕色瓶 4C保存 12 个月），临用前用纯水稀释成1nmol/mL29mmol/L 硫代巴比妥酸工作液硫代巴比妥酸0.209gEDTA.2H2025mg谷胱甘肽（还原型）用 0.02mol/L NaOH1mg50 mL 溶解（微温助溶，棕色瓶 4C保存 2

9、馏水、双蒸水淋洗干燥，试剂（选 AR 级）最好用双蒸水配制。1.341.1.3 实验步骤1.341.131 样品制备全血上清液：取血 50 卩 I 加入 0.5mL 生理盐水，2000r/min 离心 10min，取上清液待测。实用标准文档大全血清样品：取血 0.5mL 室温静置 10min，2000r/min 离心 10min，取上清液待测。1.341.132 标准曲线制作将

10、浴 60min 宀流水 冷却至室温T3mL正丁醇振荡抽提 1min 宀 3000r/min 离心 5min 宀取上清液（正丁醇层）测 荧光强度（入射狭缝 1.5nm，出射狭缝 5nm,激发波长 536nm,发射波长 550nm）以四乙氧基丙烷浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标作图。1.341.133 样品测定试剂空白管样本管标准管10mL 具塞离心管0.1mL 蒸馏水0.1mL

）是细胞膜脂质过氧化的终产物之一，测其含量可间接估计脂质过氧化的程度。1 个丙二醛（MDA ）分子与 2 个硫代巴比妥酸（TBA ）分子在酸性条件 下共热，形成粉红色复合物。该物质在波长532nm 有极大吸收峰。可用分光光法进行测定。1.3.4.1.2.2 仪器与试剂仪器：可见光分

13、光光度计、酶标仪、微量加样器、恒温水浴锅、普通离心机、混旋器、 具塞离心管。试剂：0.2M 乙酸盐缓冲液 pH3.50.2M 乙酸溶液185mL0.2M 乙酸钠溶液15mL1mmol/L 四乙氧基丙烷（贮备液，4C保存 3 个月），临用前用水稀释成 40nmol/mL8.1%十二烷基硫酸钠 SDS0.8%硫代巴比妥酸 TBA0.2M 磷酸盐缓冲液 pH7.40.2M

比色注：如用试剂盒，可按试剂盒的操作要求进行。A：空白管吸光度B :样品吸光度F:四乙氧基丙烷吸光度C:四乙氧基丙烷浓度(40nmol/mL )K :稀释倍数1.342 组织中过氧化脂质降解产物丙二醛( MDA )含量测定1.3.6.2.4.2原理见 1.3.4

16、.1.2.11.3.4.2.2 仪器与试剂仪器：可见光分光光度计、酶标仪、微量加样器、恒温水浴锅、普通离心机、混旋器、具塞离心管、组织匀浆器试齐 U :见 1.3.4.1.2.21.3.4.2.3 实验步骤1.3.4.2.3.1 样品制备组织匀浆样品：取一定量的所需脏器，生理盐水冲洗、拭干、称重、剪碎，置匀浆器中，加入 0.2M 磷酸盐缓冲液，以20000r/min 匀浆

计算8-表氢氧-异前列腺素(8-lsoprostane)是体脂质氧化应激反应稳定而具有特异性的标志 物，其含量能间接反应因机体自由基的产生而导致组织细胞的脂质过氧化程度。1.343.2 仪器与试剂仪器：酶标仪、生化培养箱、微量振荡器、微量加样器、洗板机实用标准文档大全试剂

样品制备小鼠眼眦静脉丛取血，3000r/min 离心 10min。取上清液，用 EIA 缓冲液稀释 15 倍备用。1.3.4.3.3.2 样品测定按试剂盒说明操作。8-表氢氧异前列腺素标准孔浓度分别为：500 pg/mL

L2.培养用封板膜盖好酶标板，并在4C避光条件下培养 18 小时3.清洗清洗所有反应孔五次4加试剂AChE 示踪物-5 卩 L-Ellman 200 卩 L200 卩 L200 卩 L200 卩 L200 卩 L5.培养用封板膜盖好酶标板，并在常温避光条件下培养45

20、-90 分钟6.读数在波长 412nm 处测量各孔吸光度(B。在 0.3-1.0 A.U 围)标准或样品孔吸光度一 NSB 孔吸光度%B/B0=-X100B0孔吸光度一 NSB 孔吸光度以标准物的浓度的对数(log)为横坐标，B/B为纵坐标绘制标准曲线， 亦可将数据 转换成 logit(B/B0)或 lnB/B0/(1-B/B0)做为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程。将样品 的B/B。值，代入方程式，计算出样品的浓度，再乘以稀释倍数，即为样品中的8-表氢氧异前列腺素浓度。1.3.5 蛋白质氧化产物测定H2O2或 02一自由基对蛋白质氨基酸侧链的氧化可导致羰基产物的积累。羟自由基也可直接作用于肽

21、链，使肽链断裂，引起蛋白质一级结构的破坏，在断裂处产生羰基。羰基化蛋白极易相互交联、聚集为大分子从而降低或失去原有蛋白质的功能，蛋白质羰基含量可直接反映蛋白质损伤的程度。蛋白质羰基形成是多种氨基酸在蛋白质的氧化修饰过程中的早期标 志，它随着年龄的增长而增加。实用标准文档大全135.1 血清中蛋白质羰基测定1.3.7.1.1 原理被氧化后的蛋白质羰基含量增多，羰基可与2， 4-二硝基苯肼反应生成2， 4-二硝基苯腙，2, 4二硝基苯腙为红棕色的沉淀，将沉淀用盐酸胍溶解后即可在分光光度计上读取370 nm 下的吸光度值，从而测定蛋白质的羰基含量。1.3.5.1.2 仪器与试剂仪器：紫外分光光度计、

22、酶标仪、微量加样器、生化培养箱、恒温水浴锅、低温高速 离心机、混旋器、2ml 离心管。试剂：10 mmol/L 2, 4-二硝基苯肼（DNPH）99 毫克 2, 4-二硝基苯肼用 50ml 2 mol/L HCL 溶解，4C避光保存。2 mol/L HCL200 g/L 三氯乙酸（TCA ）6 mol/L 盐酸胍无水乙醇乙酸乙酯混合应用液将无水乙醇和乙酸乙酯按照体积比1: 1

值。用双缩脲法测定血清（或血浆）蛋白质含量。注：如用试剂盒，可按试剂盒的操作要求进行。1.3.5.1.4 计算公式测定管 0D-对照管 0D实用标准文档大全蛋白质羰基含量 =-x125X105（nmol/mgprot）22x比色光径（cm）x样本蛋白浓度（ mg/L）1.3

25、.5.2 组织中蛋白质羰基测定1.3.521 原理见 1.3.5.1.11.3.522 仪器与试剂仪器：紫外分光光度计、酶标仪、微量加样器、生化培养箱、恒温水浴锅、天平、匀浆器、低温高速离心机、混旋器、2ml 离心管。试剂：10 mmol/L HEPES 缓冲液 pH7.42.38 克 N-2-羟乙基哌嗪-2 乙磺酸（HEPES）溶入 1000ml 双蒸馏水，用 IN NaOH

26、 mol/L HCL 溶解，4C避光保存。2 mol/L HCL200 g/L 三氯乙酸（TCA ）6 mol/L 盐酸胍无水乙醇乙酸乙酯混合应用液将无水乙醇和乙酸乙酯按照体积比1 : 1 的比例配置成混合溶液，现用现配。1.3.5.2.3 实验步骤1.3.5.2.3.1 样品处理取 0.1g 组织，在冰的生理盐水中漂洗， 以去掉表面的血迹。加人 0.9ml 的冰的 10

4C下，以 12000r/min 离心 10min，弃上清，留沉淀无水乙醇乙酸乙酯混合应用液1.0ml1.0ml涡旋混匀 1 分钟，以 4C下，以 12000r/min 离心 10min，弃上清，留沉淀无水乙醇乙酸乙酯混合

29、 盐 酸胍试剂调零，测定 OD 值。用双缩脲法测定匀浆上清液蛋白质含量。注：如用试剂盒，可按试剂盒的操作要求进行。1.3.523.3 计算公式测定管 OD-对照管 OD蛋白质羰基含量 =-x125X105（nmol/mgprot）22x比色光径（cm）x样本蛋白浓度（ mg/L） 1.3.5.3 注意事项1.3.5.3.1 加入硫酸链霉素：在匀浆上清液中加人硫酸链霉素溶液的作用是沉淀核酸。核酸中的一些碱基如鸟嘌呤、胞嘧啶、 尿嘧啶和胸腺嘧啶等也含有羰基， 如不去除核酸，这些碱基 就会与DNP 结合，并反应生成有色物质， 这些物质会增加最后溶液的吸光度， 使结果偏大。1.3.7.1.3.1DHP

30、 啲溶解：DNP 不溶于水，只能溶于稀酸和稀碱等溶液，因此， 用 2 mol / L HC1 来溶解 DNPH 设对照管是为了避免 HC 与反应液中一些物质反应生成对比色有影响的物质。1.3.5.3.3 反应体系应避光：当蛋白质溶液中加人DNP 进行反应时，反应体系需置于黑暗中，因为 DNP 不稳定，见光会分解。如果反应体系遇到光，DNP 分解，体系中会有剩余的没有变 成蛋白质腙衍生物，对反应比色有影响。1.3.5.3.4 去除未与蛋白质结合的 DNPH 由于 DNPI 在 370nm 左右有强烈的光吸收，因而用乙醇 和乙酸乙脂混合物反复洗涤沉淀，去掉未与蛋白质结合的DNPH 否则，会增加吸光

31、值。1.3.6 抗氧化酶活力测定SOD 催化超氧阴离子自由基（O2一）生成 H2O2,再由其它抗氧化酶如谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX ）和过氧化氢酶作用生成水，这样可以清除。2-对细胞的毒害作用。SOD、GSH-Px 在动物某些器官和人体血红细胞中的含量均有明显的增龄变化，酶活性与生物年龄 的增长成反比。消除自由基的能力与酶活性成正比。1.361 血或组织中超氧化物歧化酶（SOD ）活力测定1.4.1原理O2一氧化羟胺的最终产物为亚硝酸盐，后者在对氨基苯磺酸及甲萘胺作用下呈现紫红 色，在波长530nm 处有极大吸收峰，可用分光光度法进行测定，当SOD 消除。2-后形成的亚硝酸盐减少。1.3

混合器抽提 1min ,4000r/min 离心 3min，分层，上层为 SOD 抽提液，中层为血红蛋白沉淀 物，下层为三氯甲烷，记录上清液体积待测。组织匀浆的制备：剪取一定量的所需脏器，生理盐水冲洗、拭干、称重、剪

34、碎，至玻璃匀浆器中加入冷生理盐水20000r/min 匀浆 10s,间歇 30s，反复进行三次，制成1%组织匀浆，（最好用超声波发生器处理30s）,使线粒体振破，以中性红-詹钠氏绿B 染色证明线粒体已振碎。以 4000r/min 离心 5min，取上清液 201待测。SOD 标准抑制曲线 将 SOD 标准品用磷酸盐缓冲液配制成 750U/mL 的溶液，再稀释 到 50 倍，即SOD 量为 15U/mL （1.5 卩 g/mL ,用本法测定不同量的 SOD 标准液的百分抑制 率，以百分抑制率为纵坐标，以 SOD 活力单位 U/mL 为横坐标绘制标准曲线。对照管 OD 测定管 ODSOD 百分抑制

35、率=-X100%对照管 OD计算每 mL 反应液中 SOD 抑制率达 50%时所对应的 SOD 量为一个单位。（对照管 OD-测定管 OD）X100%乘以稀释倍数（1mL/取样量）。SOD 活力（U/mL ）=对照管 OD50%反应液总量X-取液量6mL）X 样品稀释倍数也可用酶比活法即以每管样品的百分抑制率从SOD 标准曲线查出相应的 SOD U/mL ,实用标准文档大全若样品为组织匀浆液，根据匀浆浓度或组织蛋白质含量，将单位换算为 U/g 组织或 U/mg蛋白。若样品为红细胞抽提液，根据血红蛋白含量，可换算为U/g Hb。实用标准文档大全样品测定步骤:试剂测定管对照管1/15mol/L 磷

以蒸馏水调零，530nm 处比色测定 OD 值。* A 所用样品的量红细胞抽提液10gl血清（或血浆）2030gl（溶血样品剔除）1%组织匀浆1040gl注：如用试剂盒，可按试剂盒的操作要求进行。1.3.6.2 血或

37、组织中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH Px）活力测定1.4.2.1原理谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）是体存在的一种含硒清除自由基和抑制自由基反应的系统。对防止体自由基引起膜脂质过氧化特别重要，其活力以催化GSH 氧化的反应速度，及单位时间 GSH 减少的量来表示，GSH 和 5,5二硫对硝基苯甲酸 （DTNB ）反应在 GSH-Px 催化下可生成黄色的 5-硫代 2-硝基苯甲酸阴离子，于 423nm 波长有最大吸收峰，测定该离 子浓度，即可计算出GSH 减少的量，由于 GSH 能进行非酶反应氧化，所以最后计算酶活力时，必须扣除非酶反应所引起的GSH 减少。1.3.6.2.2 试剂和仪器仪器：可

40、中，充分振摇，使之全部溶血 1:100 待测，4h测定酶活力。若当天来不及测定，将肝素抗凝全血置-20C冻存，3d 测定，若 4C存放，28h必须测完。测前取出样品室温自然解冻。组织上清液：动物禁食过夜，处死后，立即取出所需脏器， 放入冷生理盐水中洗去浮血，剔除脂肪及结缔组织，滤纸吸干后，在冰浴上剪成碎块，称取适量组织，加冷0.2M 磷酸缓冲液，以 20000r/min 匀浆 10s，间歇 30s,反复 3 次制成 5%组织匀浆，操作在冰浴中进行，匀浆以 12500Xg 离心 10min （低温高速离心机），以沉淀为破碎的细胞、细胞碎片、核及线 粒体，上清液用以测胞液中的酶活力，最好当天测，否

43、min 之读数准确。*样品为组织上清液时，非酶管改为加热使酶失活的组织上清液。* 溶血液 0.1 - 0.4mL组织上清液1:20 稀释，取稀释液 0.4mL注：如用试剂盒，可按试剂盒的操作要求进行。1.3.6.2.3.4 计算鼠全血 GSH-Px 活力单位 规定每 1mL 全血， 每分钟， 扣除非酶反应的 logGSH降低 后， 使 logGSH降低 1 为一个酶活力单位。非酶管

44、Px 比活力单位规定每毫克蛋白质，每分钟，扣除非酶反应，使GSH 浓度降低 1 卩 mol/L 为一个酶活力单位。（非酶管 0D 样品管 OD）xA*x5组织 GSH-Px 比活力单位（U/mg 蛋白） =-3minx样品蛋白质的 mg 数* Folin 法或双缩脲法测样品蛋白质含量标准 GSH 浓度（卩 mol/L）* A=-即标准曲线斜率。标准 GSH 光密度（OD）1.3.6.2.4 注意事项1.3.6.2.4.1 由于 H2O2易分解导致浓度改变，临用时取贮备液用分光光度计测其浓度，取贮 备液 3mL，测定 1cm 光径的 240nm 处 OD 值。OD实用标准文档大全浓度（mmol/

45、L ）=-0.036 （消光系数）若 OD 值为 0.45，则表明 H2O2浓度为 12.5mmol/L。2.2.15-硫代 2-硝基苯甲酸阴离子的显色不仅与整个反应体系中氢离子浓度有关， 还 受反应时间限制。加入显色剂后，反应体系 pH 为 6.5 时， 11min 开始显色，此时比色 5min 读数准确。1.3.7 抗氧化物质还原型谷胱甘肽（ GSH ）测定谷胱甘肽是一种低分子清除剂，它可清除O2-、H2O2、LOOH 。谷胱甘肽是谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸组成的一种三肽，是组织中主要的非蛋白质的巯基化合物，是 GSH-PX 和 GST 两种酶类的底物，为这两种酶分解氢过氧化物所必需，它能稳

46、定含巯基的酶，和防止 血红蛋白及其它辅助因子受氧化损伤，缺乏或耗竭 GSH 会促使许多化学物质或环境因素产 生中毒作用， GSH 量的多少是衡量机体抗氧化能力大小的重要因素。1.3.7.1 血或组织中还原型谷胱甘肽（ GSH ）测定方法2.5.1.1原理GSH-和 5, 5-二硫对硝基甲酸（DTNB ）反应在 GSH-Px 催化下可生成黄色的 5-硫代 2-硝基甲酸阴离子，于 420nm 波长有最吸收峰，测定该离子浓度，即可计算 GSH 的含量。2.5.1.2仪器和试剂仪器：可见光分光光度计、酶标仪、低温高速离心机、匀浆器、恒温水浴锅、微量加样器试剂： 0.9生理盐水4磺基水酸溶液0.1mol

48、3.2样品制备：溶血液上清液：取 0.1mL 抗凝全血加双蒸水 0.9mL（1： 9 溶血液） ，充分混匀，直至透 亮为止。取溶血液 0.5mL 加 4%磺基水酸 0.5mL 混匀，室温下 3500rpm 离心 10 分钟，取上 清液备用。实用标准文档大全血清上清液： 取 0.1mL 血清加 4%磺基水酸 0.1mL 混匀， 室温下 3500rpm 离心 10 分钟， 取上清液备用。组织上清液：取组织 0.5g 加生理盐水 4.5mL 充分研磨成细浆（10%肝匀浆），混匀后取实用标准文档大全浆液 0.5mL 加 4%磺基水酸 0.5mL 混匀，室温下 3500rpm 离心 10 分钟，取上清液

处测定吸光度。注：该指标检测，需新鲜样品取材后当天完成。用双缩脲法测定血清（或溶血液）、 组织匀浆蛋白质含量。如用试剂盒，可按试剂盒的操作要求进行。1.3.7.1.3.3 标准曲线取 1mmol/L GSH 标准溶液 0、10、20、50、100、150、200

52、 gprot/L实用标准文档大全1.4 数据处理与结果判定2.7.3.4数据处理一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算 F 值，F 值 FO.O5，结论：各组均数间差异无显著性；F 值FO.O5,PW0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换， 待满足正态或方差齐要求后， 用转换后的数据进行统计； 若变量转换后仍未达到正态或方差 齐的目的，改用秩和检验进行统计。2.7.3.5指标判定2.7.3.5.2 脂质氧化产物 受试样品组与模型（或老龄）对照组比较，过氧化脂质（丙二醛或8-表氢氧异前列腺素）含量

53、降低有统计学意义，判定该受试样品有降低脂质过氧化作用，该项指标结果阳性。2.7.3.5.3 蛋白质氧化产物受试样品组与模型（或老龄）对照组比较，蛋白质羰基含量降低有统计学意义，判定该 受试样品有降低蛋白质过氧化作用，该项指标结果阳性。2.7.3.5.4 抗氧化酶活力受试样品组与模型（或老龄）对照组比较，抗氧化酶（ SOD 或 GSH-PX ）活力升高有 统计学意义，判定该受试样品有升高抗氧化酶活力作用，该项指标结果阳性。2.7.3.5.5 抗氧化物质 GSH受试样品组与模型（或老龄）对照组比较， GSH 含量升高有统计学意义，判定该受试 样品有升高抗氧化物质 GSH 作用，该项指标结果阳性。1

54、.4.3 结果判定过氧化脂质含量、 蛋白质羰基、 抗氧化酶活性、 还原性谷胱甘肽四项指标中三项指标阳 性，可判定该受试样品抗氧化动物实验结果阳性。2 人体试食试验受试者纳入标准选年龄在 18 65 岁，身体健康状况良好，无明显脑、心、肝、肺、肾、血液疾患，无 长期服药史，志愿受试保证配合的人群。排除受试者标准妊娠或哺乳期妇女，对保健食品过敏者。合并有心、肝、肾和造血系统等严重疾病患者。短期服用与受试功能有关的物品，影响到对结果的判断者。实用标准文档大全不符合纳入标准，未按规定食用受试样品，无法判定功效或资料不全影响功效或安全性判断者。2.3 受试者分组对受试者按 MDA、SOD、GSH-Px

55、水平随机分为试食组和对照组，尽可能考虑影响结 果的主要因素如年龄、性别、生活饮食习惯等，进行均衡性检验，以保证组间的可比性。每 组受试者不少于 50 例。2.4 试验方法采用自身和组间两种对照设计。试验组按推荐服用方法、 服用量每日服用受试产品， 对照组可服用安慰剂或采用阴性对照。受试样品给予时间 3 个月，必要时可延长至 6 个月。试验期间对照组和试食组原生活、饮食不变。2.5 观察指标各项指标在试验开始及结束时各检测1 次。2.5.1 安全性指标般状况包括精神、睡眠、饮食、大小便、血压等2.5.1.2 血、尿、便常规检查2.5.1.3 肝、肾功能检查2.5.1.4 胸透、心电图、腹部 B

57、SOD 升高百分率=100%试验前 SOD2.5.2.3 谷胱甘肽过氧化物酶观察试验前后 GSH PX 的变化及 GSH PX 升高百分率。（测定方法见 2.7）实用标准文档大全试验前 GSH PX 试验后 GSH PXGSH PX 升高百分率=X100%试验前 GSH PX2.6 数据处理和结果判定凡自身对照资料可以采用配对t 检验，两组均数比较采用成组 t 检验，后者需进行方差齐性检验，对非正态分布或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态方差齐后， 用转换的数据进行 t 检验；若转换数据仍不能满足正态方差齐要求，改用t 检验或秩和检验；但变异系数太大（如 CV50 %）的资料应用秩和

58、检验。在试验前组间比较差异无显著性的 前提下，可进行试验后组间比较。各功效观察指标试验前后自身比较和试食后组间比较均有统计学意义，方可判定该指标阳性。过氧化脂质含量、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶三项实验中任二项实验结果阳 性，可判定该受试样品具有抗氧化功能作用。2.7 血中谷胱甘肽过氧化物酶（ GSH Px）活力测定2.7.1 原理谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）是体存在的一种含硒清除自由基和抑制自由基反应的 系统。对防止体自由基引起膜脂质过氧化特别重要，其活力以催化GSH 氧化的反应速度，及单位时间 GSH 减少的量来表示，GSH 和 5, 5-二硫对硝基苯甲酸（DTNB ）反应在

59、GSH-Px 催化下可生成黄色的 5-硫代 2-硝基苯甲酸阴离子，于 423nm 波长有最大吸收峰，测定该离 子浓度，即可计算出GSH 减少的量，由于 GSH 能进行非酶反应氧化， 所以最后计算酶活力 时，必须扣除非酶反应所引起的GSH 减少。2.7.2